趙力超，陳潔蘭，王 燕，劉 欣

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642)

菠蘿莖蛋白酶含有多種不同蛋白水解酶組分，對(duì)多種蛋白質(zhì)及多肽具有催化水解活性，在醫(yī)藥和食品工業(yè)上應(yīng)用廣泛［1］。菠蘿蛋白酶作為一種生物大分子，與大部分酶一樣存在活力不穩(wěn)定問題，極易受到生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過程中諸多因素影響［2］，極大地限制了其生產(chǎn)和應(yīng)用［3］。因此，其應(yīng)用領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)在于活性保護(hù)劑的研發(fā)和分子水平失活機(jī)理的闡釋。目前對(duì)于菠蘿蛋白酶失活和激活方面的研究，大多集中于活力影響因素種類和水平、活力保護(hù)劑種類和用量等方面的研究［4］。對(duì)其在儲(chǔ)存和加工應(yīng)用過程中不同因素造成失活機(jī)理、激活機(jī)理暫未見系統(tǒng)報(bào)道。通過分子構(gòu)象分析菠蘿莖蛋白酶失活、激活機(jī)理，對(duì)于生產(chǎn)中采用相應(yīng)的活力保護(hù)手段(添加蛋白熱穩(wěn)劑、還原劑、防腐劑、疏水基、巰基保護(hù)劑等)，使酶在儲(chǔ)存和應(yīng)用過程中的穩(wěn)定性提高，具有很好的應(yīng)用指導(dǎo)意義。作者前期已對(duì)多種的添加劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶的影響進(jìn)行了系統(tǒng)研究［5］，本文選擇其中不同種類的抑制劑和激活劑進(jìn)行進(jìn)一步構(gòu)效關(guān)系研究。菠蘿莖蛋白酶溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要內(nèi)容就是其氨基酸殘基的微區(qū)結(jié)構(gòu)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的活性部位往往就在這些微區(qū)上，芳香氨基酸因常在蛋白質(zhì)功能方面表現(xiàn)重要作用且便于研究，在氨基酸微區(qū)的研究中占有重要地位［6］。菠蘿莖蛋白酶由其特定的空間構(gòu)象決定了其特有的生物功能。溶液構(gòu)象研究是從宏觀上掌握菠蘿莖蛋白酶整體結(jié)構(gòu)和了解菠蘿莖蛋白酶在生理狀態(tài)下發(fā)揮活性作用時(shí)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)的關(guān)鍵。研究抑制劑和激活劑與酶的相互作用，是從分子水平上闡明酶失活和激活機(jī)理的基礎(chǔ)。本文采用紫外光譜法和CD光譜法，研究不同抑制劑和激活劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶活力、動(dòng)力學(xué)參數(shù)及光譜特性等的影響，綜合失活和激活兩方面的規(guī)律，總結(jié)菠蘿莖蛋白酶構(gòu)效變化機(jī)制，為菠蘿莖蛋白酶的工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

表1 不同濃度抑制劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶酶活的抑制率(%)Table1 Inhibition rate of stem bromelain with different concentrations of inhibitors(%)

表2 不同濃度抑制劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶的Km和Vmax的影響Table2 Kmand Vmaxof stem bromelain with different concentrations of inhibitors

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿莖蛋白酶 由湛江徐聞縣美侖生物制品有限公司提供;其它試劑 均為分析純。

Jasco 500c型圓二色譜儀 日本Jasco公司;UV－3010紫外可見分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶活測(cè)定 參考施特爾馬赫［7］酪蛋白法。

1.2.2 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定 酶解動(dòng)力學(xué)利用米氏(Michaelis－ Menten)方程計(jì)算［8］，酶變性速度利用Guggenheim法計(jì)算［9］，變性速率常數(shù)查考鄒承魯法［10］。

1.2.3 紫外差吸收光譜測(cè)定 采用紫外－可見分光光度儀檢測(cè)190～400nm的紫外吸收光譜(雙光束，狹縫寬度1.0nm，石英吸收池光徑10mm，室溫25℃)。結(jié)合參比，繪制紫外差吸收光譜。

1.2.4 CD光譜測(cè)定 采用圓二色譜儀檢測(cè)190～240nm的遠(yuǎn)紫外吸收光譜(100μL液池，光徑0.lmm，25℃恒溫)，數(shù)據(jù)采集間隔0.5nm，累加4次測(cè)量求平均值消除儀器噪音。用儀器附帶的Moffit－Yang運(yùn)算法，計(jì)算樣品分子中各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。

1.2.5 抑制劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶構(gòu)象與活力的影響抑制劑選擇Cu2+和十二烷基磺酸鈉(SDS)，Cu2+的終濃度設(shè)定為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L，SDS 終濃度設(shè)定為 2、4、6、8、10mmol/L。測(cè)定不同濃度抑制劑存在時(shí)菠蘿莖蛋白酶以上相關(guān)指標(biāo);測(cè)定紫外差吸收光譜時(shí)，處理時(shí)間為10min;測(cè)定 CD色譜時(shí)，固定Cu2+濃度 0.6mmol/Lol/L、SDS 濃度 6mmol/Lol/L，處理時(shí)間為10min。酶活抑制率(%)=(對(duì)照酶活－各試劑處理后酶活)/對(duì)照酶活×100。

1.2.6 激活劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶構(gòu)象與活力的影響激活劑選擇乙二胺四乙酸二鈉(EDTA－2Na)、偏重亞硫酸鈉(Na2S2O5)、β－巰基乙醇(β－ME)，Na2S2O5的終濃度分別為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mmol/L，EDTA－2Na和 β－ME 的終濃度設(shè)定為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L。相對(duì)酶活 =添加激活劑的酶活/不加激活劑的酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶構(gòu)象與活力的影響

2.1.1 抑制劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶活力的影響 不同濃度Cu2+和SDS一定時(shí)間內(nèi)對(duì)菠蘿莖蛋白酶活力的影響情況如表1所示。

由表1可知，在抑制劑作用下菠蘿莖蛋白酶活力明顯降低，且隨抑制劑濃度的升高、作用時(shí)間的延長繼續(xù)降低。在1.0mmol/L Cu2+或10mmol/L SDS存在時(shí)，作用50min，酶活基本被全部抑制。

2.1.2 抑制劑抑制類型分析 在含有不同濃度Cu2+和SDS的環(huán)境中，菠蘿莖蛋白酶Km和Vmax值如表2所示。

由表2可知，Cu2+對(duì)菠蘿莖蛋白酶的抑制作用為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，最大反應(yīng)速度Vmax沒有變化，而抑制常數(shù)Km值隨Cu2+濃度的增大而下降。Cu2+的抑制機(jī)制可能是因其與菠蘿莖蛋白酶催化中心的巰基(E－SH)形成巰醇鹽(E－S－Cu)［11］。從而導(dǎo)致酶與底物的可結(jié)合性變小，從而導(dǎo)致Km下降。而SDS對(duì)菠蘿莖蛋白酶的抑制作用為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制常數(shù)Km值沒有變化，而最大反應(yīng)速度Vmax隨SDS濃度的增大而下降。Ibel等人［12］提出表面活性劑與蛋白質(zhì)的作用主要是疏水基與蛋白質(zhì)發(fā)生作用，而陰離子表面活性劑的親水基端與酶分子可能發(fā)生吸附作用。當(dāng)表面活性劑濃度較高時(shí)，與同一酶分子結(jié)合的表面活性劑分子數(shù)增多，它們之間的相互作用太強(qiáng)亦會(huì)破壞酶的活性。同時(shí)，由于SDS是一種電解質(zhì)，因此能通過離子效應(yīng)減弱維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的靜電相互作用。

表3 不同濃度抑制劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶變性與失活速度的影響Table3 Degeneration and inactivation rate constants of stem bromelain with different concentrations of inhibitors

2.1.3 抑制劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶的變性和失活速度的影響 在含有不同濃度Cu2+和SDS的環(huán)境中，菠蘿莖蛋白酶的變性和失活速度分別如表3所示。

由表3可知，Cu2+和SDS作用下的菠蘿莖蛋白酶失活表現(xiàn)出兩相變化，快相變化速度是慢相的兩個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，酶的變性與失活表現(xiàn)為不同步性，快相的失活速度高于變性速度，而慢相的失活速度則低于變性速度。抑制劑作用下菠蘿莖蛋白酶的失活表現(xiàn)為快慢兩相，這意味著可能存在著變性與失活的多相反應(yīng)中間過渡態(tài)。對(duì)于酶反應(yīng)前期這種快失活慢變構(gòu)的特征，說明酶的活性部位位于對(duì)Cu2+較為脆弱的特殊的構(gòu)象區(qū)域，與整個(gè)酶分子比較，對(duì)Cu2+更為敏感，其構(gòu)象的輕微變化迅速地影響到酶的催化活性，這可能涉及維系酶活力中心的次級(jí)鍵牢固程度不同所致［13］。該結(jié)論與Cu2+為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑相一致。而從SDS的快失活慢變構(gòu)的特征說明，雖然SDS是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，但酶活性部位較整體構(gòu)象而言更容易受到SDS的影響，使酶活力變化快于其整體構(gòu)象的變化［6］。

2.1.4 抑制劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶構(gòu)象的影響 在含有不同濃度Cu2+和SDS的環(huán)境中，菠蘿莖蛋白酶紫外吸收差光譜圖分別如圖1和圖2所示。根據(jù)菠蘿莖蛋白酶CD譜圖(略)，計(jì)算出菠蘿莖蛋白酶分子中各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，如表4所示。

表4 抑制劑處理后菠蘿莖蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化Table4 The percentages of the secondary structure of stem bromelain with inhibitors

圖1 不同濃度Cu2+影響下菠蘿莖蛋白酶紫外差吸收光譜圖Fig.1 UV difference absorption spectra of stem bromelain with different Cu2+concentrations

圖2 不同濃度SDS影響下菠蘿莖蛋白酶紫外差吸收光譜圖Fig.2 UV difference absorption spectra of stem bromelain with different SDS concentrations

由圖1和表4可看出，含Cu2+菠蘿莖蛋白酶的紫外差吸收光譜變化相對(duì)劇烈，在190～330nm出現(xiàn)差吸收負(fù)峰，并隨著Cu2+離子濃度的增加，吸收峰強(qiáng)度增大，其主要的兩個(gè)負(fù)吸收峰位分別位于202、250nm處，但峰型并不是非常顯著。而二級(jí)結(jié)構(gòu)中α－螺旋含量顯著下降，β－折疊、β－轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲含量都稍提高。推測(cè)Cu2+與酶蛋白的結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，芳香族氨基酸的位置暴露，更加親水或者蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變得更加松散，從而使得Cu2+離子結(jié)合后菠蘿莖蛋白酶的紫外光譜發(fā)生明顯變化［14－15］。

由圖2可看出，不同濃度SDS處理后菠蘿莖蛋白酶的紫外吸收光譜發(fā)生明顯變化，在196、232nm處出現(xiàn)差吸收負(fù)峰，并隨著SDS濃度的增大負(fù)峰強(qiáng)度增大;在220nm處出現(xiàn)差吸收正峰，且隨著SDS濃度的增大正峰強(qiáng)度逐漸減弱;在270～310nm出現(xiàn)寬而扁平的差吸收負(fù)峰，也隨著SDS濃度的增大負(fù)峰強(qiáng)度有增大趨勢(shì)。酶在 220［6］、232nm［16］處差吸收峰說明了酶的α－螺旋度值的降低，肽鏈變的松散，酶分子由有序結(jié)構(gòu)變成無規(guī)卷曲。Trp在220nm左右有強(qiáng)吸收峰［17］，210～230nm 范圍內(nèi)的差光譜正峰的出現(xiàn)反映了色氨酸殘基微環(huán)境的改變。Fasman［18］認(rèn)為225～235nm的吸收差變化與芳香族氨基酸和二硫鍵微環(huán)境變化相關(guān)，278、286、295nm出現(xiàn)差吸收峰說明酶分子中Tyr、Trp和Phe由深埋在分子內(nèi)部轉(zhuǎn)移到分子表面的極性環(huán)境中，改變程度隨SDS濃度增大而擴(kuò)大。所以，SDS的加入，使菠蘿莖蛋白酶的肽鏈發(fā)生去折疊或某種程度的伸展，原來深埋于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來，其內(nèi)部的疏水基團(tuán)或疏水結(jié)合點(diǎn)裸露從而使紫外吸收變?nèi)酢?/p>

表5 菠蘿莖蛋白酶在不同濃度激活劑中的相對(duì)酶活Table5 Relative enzyme activity of stem bromelain with different concentrations of activators

實(shí)驗(yàn)中菠蘿莖蛋白酶在2mmol/L SDS溶液中變性達(dá)到平衡時(shí)紫外光譜未發(fā)生大的變化，但酶的活力已喪失約70%。該階段酶的失活明顯早于酶分子整體構(gòu)象變化，這表明酶的活性部位處于分子中有限的容易被抑制劑擾亂的區(qū)域?；钚圆课唤Y(jié)構(gòu)及有關(guān)臂運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)與整體構(gòu)象相比更具柔性。本文結(jié)果支持了鄒氏酶活性部位的柔性理論。

2.2 激活劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶構(gòu)象與活力的影響

2.2.1 激活劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶活力的影響 不同濃度EDTA－2Na、Na2S2O5和β－ME一定時(shí)間內(nèi)對(duì)菠蘿莖蛋白酶活力的影響情況如表5所示。

由表 5可見，在含有 EDTA－2Na、Na2S2O5和β－ME的環(huán)境中，菠蘿莖蛋白酶活力均出現(xiàn)一定程度的提高，其相對(duì)活力均大于1。激活能力由大到小為:Na2S2O5＞β－ME＞EDTA－2Na。不同濃度激活劑處理菠蘿莖蛋白酶，在一定范圍內(nèi)酶活性隨激活劑濃度升高而增強(qiáng)，但當(dāng)激活劑超過一定濃度后，酶活又隨著激活劑濃度增大而緩慢降低。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于適當(dāng)濃度的激活劑更容易改變酶的構(gòu)象，使之處于一種活化的狀態(tài)，內(nèi)部被氧化的Cys殘基能更多地接觸到激活劑，酶分子則可以更好地調(diào)整構(gòu)象，使之更有利于催化。而當(dāng)體系中激活劑濃度超過最佳值時(shí)，它對(duì)酶構(gòu)象的改變超出了酶的承受能力，雖然更有利于酶的激活，但有一定破壞作用。

2.2.2 激活劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶構(gòu)象的影響 在含有不同濃度EDTA－2Na、Na2S2O5及β－ME的環(huán)境中，菠蘿莖蛋白酶紫外差光譜圖分別如圖3～圖5所示。根據(jù)菠蘿莖蛋白酶CD譜圖(略)，計(jì)算出菠蘿莖蛋白酶分子中各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，如表6所示。

圖3 不同濃度EDTA－2Na影響下菠蘿莖蛋白酶紫外差吸收光譜圖Fig.3 UV difference absorption spectra of stem bromelain with different EDTA－2Na concentrations

圖4 不同濃度Na2S2O5影響下菠蘿莖蛋白酶紫外差吸收光譜圖Fig.4 UV difference absorption spectra of stem bromelain with different Na2S2O5concentrations

表6 激活劑處理后菠蘿莖蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化Table6 The percentages of the secondary structure of stem bromelain with activators

由圖3～圖5可知，隨著激活劑的添加，菠蘿莖蛋白酶紫外差吸收峰主要出現(xiàn)在230nm以下，且最大差吸收峰位于197～200nm之間。一般認(rèn)為230nm以下的差光譜可以反映酶蛋白主鏈構(gòu)象的變化，240～300nm范圍內(nèi)的差光譜則是 Trp、Tyr、Phe以及－S－S－的貢獻(xiàn)。所以，激活劑作用下菠蘿莖蛋白酶分子構(gòu)象只涉及主鏈構(gòu)象的變化，未涉及基團(tuán)構(gòu)象的變化，激活劑作用下雖然改變了酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但并未造成疏水基團(tuán)的暴露，酶分子的活性中心仍被疏水基團(tuán)圍繞。因此，酶分子活力得到保持。而抑制劑作用下酶分子的構(gòu)象變化更為劇烈，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生松散，疏水基團(tuán)發(fā)生暴露并在230nm產(chǎn)生Phe、Tyr和Trp的吸收峰，從而造成酶分子活力下降。

圖5 不同濃度β－ME影響下菠蘿莖蛋白酶紫外差吸收光譜圖Fig.5 UV difference absorption spectra of stem bromelain with different β－ME concentrations

表6顯示，激活劑作用下菠蘿莖蛋白酶分子均出現(xiàn)α－螺旋含量下降、β－轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量增加，酶分子結(jié)構(gòu)趨向于松散，但其構(gòu)象的變化并不如添加SDS和Cu2+時(shí)劇烈。相反，由于酶分子結(jié)構(gòu)的松散，激活劑更易于進(jìn)入酶分子的疏水區(qū)對(duì)已經(jīng)氧化的巰基進(jìn)行還原，底物也更易于進(jìn)入酶分子的疏水裂隙，造就了一種酶分子與底物結(jié)合更為容易的狀態(tài)，使得酶分子被激活。所以，酶的激活現(xiàn)象是有普遍性的，許多酶在一定化學(xué)試劑的作用下可以提高活性，這說明酶的天然構(gòu)象并不一定是其表現(xiàn)活力的最佳構(gòu)象。酶活性部位柔性假說認(rèn)為，酶的激活現(xiàn)象“雖然很可能也同時(shí)發(fā)生了酶分子整體的部分伸展，但活力的提高仍然是由于適當(dāng)增加了酶活性部位柔性所造成的”［19］。但這種結(jié)構(gòu)的松散并不是越大越好，其存在一個(gè)度的問題，與二級(jí)結(jié)構(gòu)α－螺旋、β－轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的變化程度有關(guān)。

本文很好驗(yàn)證了這一點(diǎn)，酶分子的激活需要α－螺旋一定程度的下降。EDTA－2Na處理下酶分子α－螺旋下降程度不夠(α－螺旋含量由15.7下降到14.5)，酶活提高不明顯;偏Na2S2O5和β－ME處理下酶分子α－螺旋下降程度較EDTA－2Na大(α－螺旋含量由15.7分別下降到9.7和9.1)，其中，Na2S2O5對(duì)酶活的提升最明顯;繼續(xù)降低酶分子α－螺旋含量，SDS和Cu2+作用下酶分子α－螺旋含量下降最明顯，但卻表現(xiàn)出酶活的抑制作用。反觀β－轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲也可得出類似結(jié)果。這就表明菠蘿莖蛋白酶分子的激活和失活均取決于其二級(jí)構(gòu)象的變化程度。

3 結(jié)論

本文首次采用紫外差光譜法、CD光譜法并結(jié)合酶解動(dòng)力學(xué)、失活動(dòng)力學(xué)等基本數(shù)據(jù)，綜合菠蘿莖蛋白酶的失活和激活兩方面實(shí)驗(yàn)，從構(gòu)象和活力變化的規(guī)律闡述酶的失活及激活機(jī)理。研究表明，抑制劑與激活劑作用下菠蘿莖蛋白酶CD圖譜均表現(xiàn)為α－螺旋度降低，β－折疊、β－轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲含量的不同程度提高，但抑制劑作用下螺旋降低、折疊與卷曲的升高程度更明顯。此外，抑制劑與激活劑作用下菠蘿莖蛋白酶的紫外差吸收光譜也顯示差異，激活劑作用下主要表現(xiàn)為230nm以下的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，而抑制劑除上述變化外，還顯示生色基團(tuán)Trp、Tyr、Phe的暴露，表明抑制劑作用下酶分子構(gòu)象變化更劇烈。進(jìn)一步推測(cè):酶分子的天然構(gòu)象并非其活力表現(xiàn)最適構(gòu)象，酶分子的適度松散，更有利于激活劑進(jìn)入活性中心，從而還原巰基，激活酶分子，同時(shí)，酶分子的適度松散可能更有利于底物進(jìn)入活性中心進(jìn)行催化作用，提高酶分子活力。

［1］Khatoon H，Saleemuddin M.Stem bromelain:An enzyme that naturally facilitates oriented immobilization［J］.Protein and Peptide Letters，2007，14:233－236.

［2］王燕，趙力超，陳潔蘭，等.菠蘿蛋白酶工業(yè)化提取工藝的改良及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(10):353－357.

［3］吳茂玉，馬超，喬旭光，等.菠蘿蛋白酶的研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］.食品科技，2008(8):17－20.

［4］Amid A，Ismail N A，Yusof F，et al.Expression，purification，and characterization of a recombinant stem bromelain from Ananas comosus［J］.Process Biochemistry，2011，46:2232－2239.

［5］趙力超，王燕，何鳳林，等.多糖和添加劑對(duì)菠蘿莖蛋白酶活力的影響［J］.食品科學(xué)，2011，32(15):225－229.

［6］王黎明.表面活性劑SDBS、SDS和CTMAB對(duì)土壤酸性磷酸酶的影響及機(jī)理研究［D］.浙江大學(xué)，2004.

［7］施特爾馬赫.酶的測(cè)定方法［Z］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1992:24.

［8］ Murachi T，Yasuda Y.Purification and physical characterization of stem bromelain.［J］.Biochemistry，1964:48－55.

［9］吳友吉，金盈.Guggenheim法在物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用［J］.科技信息，2010(13):564.

［10］鄒承魯.酶活性部位的柔性［J］.科學(xué)通報(bào)，1989，4(5):398－407.

［11］Kamphuis I G，Swarte M B.Structure of papain refined at 1.65 A resolution.［J］.Journal of Molecular Biology，1984，179:233－256.

［12］Ibel K，Kirschner K，Mascher E.Protein－decorated micelle structure of sodium－dodecyl－sulfate－protein complexes as determined by neutron scattering.［J］.European Journal of Biochemistry，1990，190:311－318.

［13］顏思旭，余衛(wèi)平.縊蟶兩種堿性磷酸酯酶與十二烷基磺酸鋰作用過程中構(gòu)象與活力變化的差異［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1985，21(1):128－132.

［14］林沁瑛，林青松，汪白樺，等.中華獼猴桃蛋白酶在半極性介質(zhì)中的構(gòu)象變化和動(dòng)力學(xué)研究［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1993，32(2):210－215.

［15］馮永君，李德舜，孫麗，等.火菇素酪氨酸微區(qū)的研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2000，58(8):1037－1042.

［16］Glazer A N.Studies on the ultraviolet difference spectra of proteinsand polypeptides［J］.The JournalofBiological Chemistry，1961:2943－2947.

［17］陶慰孫.蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)［Z］.北京:人民教育出版社，1981:225－247.

［18］Fasman G D，Randall L L.Chaperone SecB:Conformational changes demonstrated by circular dichroism［J］.Journal of Protein Chemistry，1995，14:595－600.

［19］鄒承魯 .活性部位的柔性［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，2001，32(1):7－12.