陳 仿,靳孝慶,曹廣祥,張曉曉,王珊珊,鐘傳青

(1.魯南制藥集團科研部,山東臨沂276000;2.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院,山東濟南250101)

克拉維酸鉀中有關(guān)物質(zhì)G的化學(xué)合成與結(jié)構(gòu)鑒定

陳 仿1,靳孝慶1,曹廣祥1,張曉曉1,王珊珊2,鐘傳青2

(1.魯南制藥集團科研部,山東臨沂276000;2.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院,山東濟南250101)

以L-酪氨酸和琥珀酸酐為原料、氯化鋰為催化劑、冰醋酸為反應(yīng)溶劑合成了藥品克拉維酸鉀中的有關(guān)物質(zhì)G。研究了反應(yīng)溶劑的種類、反應(yīng)物料配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等因素對有關(guān)物質(zhì)G收率及純度的影響,在L-酪氨酸和琥珀酸酐的摩爾比為1∶1.5、95℃加熱反應(yīng)1.0 h的優(yōu)化條件下,有關(guān)物質(zhì)G粗品的最高純度達到87.4%,收率為85. 7%。通過制備液相色譜對粗品進行純化,有關(guān)物質(zhì)G的純度達到99.6%,總收率為68.6%。采用LC-MS/MS對所合成物質(zhì)進行了結(jié)構(gòu)鑒定,確定其為歐洲藥典中克拉維酸鉀的有關(guān)物質(zhì)G。

克拉維酸;有關(guān)物質(zhì)G;化學(xué)合成;結(jié)構(gòu)鑒定

克拉維酸(Clavulanic acid)是一種不可逆性競爭型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑,可與β-內(nèi)酰胺酶的絲氨酸活性位點不可逆結(jié)合,從而保護β-內(nèi)酰胺類抗生素的活性[1,2]。隨著細菌耐藥性的不斷增強,克拉維酸在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛,最成功的例子就是葛蘭素公司的Augmentin(克拉維酸鉀與阿莫西林的復(fù)合制劑)[3,4]?？死S酸鉀一般采用發(fā)酵法生產(chǎn),生產(chǎn)過程中始終存在N-琥珀酰酪氨酸(結(jié)構(gòu)式見圖1),在歐洲藥典中標識為有關(guān)物質(zhì)G,并且不容易在提取過程中去除[5]。隨著人們對藥品質(zhì)量的要求越來越高,有關(guān)物質(zhì)G因為對藥品質(zhì)量影響很大,其含量要求也越來越嚴格,因此研究有關(guān)物質(zhì)G的性質(zhì)、控制生產(chǎn)過程中有關(guān)物質(zhì)G的產(chǎn)生、降低藥品中有關(guān)物質(zhì)G的含量非常關(guān)鍵。由于克拉維酸鉀中有關(guān)物質(zhì)G的標準品的價格極其昂貴,嚴重限制了對其性質(zhì)的研究。

圖1 有關(guān)物質(zhì)G的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 The molecular structure of the related substance G

作者分別采用酸酐法和酰氯法合成克拉維酸鉀有關(guān)物質(zhì)G,并通過LC-MS/MS對所合成物質(zhì)進行了結(jié)構(gòu)鑒定,以期為研究有關(guān)物質(zhì)G的生成機制、控制方法和提高克拉維酸鉀藥品質(zhì)量提供幫助。

1 實驗

1.1 主要試劑與儀器

L-酪氨酸(生物純)、琥珀酸酐(化學(xué)純)、有關(guān)物質(zhì)G標準品(Council of Europe-EDQM CS 30026F-67081 Strasbourg Cedex)、氯化鋰、冰醋酸、乙酸乙酯、碳酸氫鉀、無水乙醇、乙腈(色譜純)、三氟乙酸、丁二酰氯、四氫呋喃、硫酸。所用試劑除注明外均為分析純。

R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,循環(huán)水式真空泵,HDM-250B型電加熱套,DLSB型低溫冷卻循環(huán)泵,梅特勒AL104型分析天平,LGJ-10型冷凍干燥機,DZF-6050B型真空干燥箱,Agilent 1100型液相色譜儀,北京創(chuàng)新通恒制備色譜儀(50 m L泵,UV檢測器,5 m L定量環(huán)),Agilent 1200-6410型液相質(zhì)譜儀。

1.2 合成方法

1.2.1 酸酐法

稱取7.81 g L-酪氨酸和6.00 g琥珀酸酐放入250 m L三口燒瓶中,加入50 m L冰醋酸和0.2 g氯化鋰,放入電熱套中加熱,常壓下緩慢升溫至95℃,攪拌回流反應(yīng)1.0 h。將反應(yīng)液減壓蒸餾至無液體滴出后,向三口燒瓶中加入50 mL純水,攪拌溶解,再用50 mL乙酸乙酯萃取水相3次,合并乙酸乙酯相。將乙酸乙酯萃取液置于低溫冷卻循環(huán)泵中,-20℃冷凍除水,過濾去除冰渣。向除水后的乙酸乙酯相中加入20 m L 20%碳酸氫鉀溶液進行反萃,攪拌20 min后,靜置,分出重相液,向其中加入1 L無水乙醇,室溫下養(yǎng)晶1 h。抽濾,濾餅80℃真空干燥2 h,得有關(guān)物質(zhì)G粗品。

圖2 酸酐法合成有關(guān)物質(zhì)G的化學(xué)反應(yīng)式Fig.2 Chemical reaction of synthesis of the related substance G by acid anhydride method

1.2.2 酰氯法

稱取5.40 g L-酪氨酸放入250 m L三口燒瓶中,加入120 m L飽和碳酸氫鉀溶液并將三口燒瓶置于低溫冷卻循環(huán)泵中,0℃下緩慢滴加含有0.12 mol丁二酰氯的四氫呋喃溶液80 m L。滴加完畢后,保持0℃反應(yīng)6 h。將反應(yīng)液30℃減壓蒸餾至無液體滴出后,向三口燒瓶中加入50 m L水溶解并用18%H2SO4調(diào)p H值至1.4。加入等體積的乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯相。后續(xù)操作同1.2.1。

圖3 酰氯法合成有關(guān)物質(zhì)G的化學(xué)反應(yīng)式Fig.3 Chemical reaction of synthesis of the related substance G by acyl chloride method

1.3 制備液相色譜法純化有關(guān)物質(zhì)G

稱取有關(guān)物質(zhì)G粗品適量,加水溶解制成濃度約為20 mg·m L-1的溶液,進制備液相色譜。從制備液相色譜中接出的溶液,經(jīng)高效液相色譜檢測確定為純有關(guān)物質(zhì)G后收集,減壓蒸餾至沒有液體蒸出后,冷凍干燥,得白色晶體有關(guān)物質(zhì)G。

色譜條件:C18色譜柱(30 mm×250 mm,10μm);流動相:10%乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液;流速:30 m L·min-1;檢測波長:280 nm;進樣量:5 m L。

1.4 測試與表征

1.4.1 高效液相色譜分析[5]

1.4.1.1 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5μm);流動相:10%乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液;流速:1 m L·min-1;柱溫:40℃;檢測波長:280 nm;進樣量:20μL。

1.4.1.2 溶液的配制

標準品溶液:精密稱取克拉維酸鉀有關(guān)物質(zhì)G標準品適量,加水溶解并制成濃度約為0.15 mg·m L-1的溶液,作為標準品溶液。

供試品溶液:精密稱取供試品適量,加水溶解并制成濃度約為0.15 mg·mL-1的溶液,作為供試品溶液。

1.4.1.3 樣品檢測

取標準品溶液和供試品溶液分別進樣,用外標法計算供試品含量。

1.4.2 結(jié)構(gòu)鑒定

采用LC-MS/MS對所合成物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定。

離子化方式:ESI;離子模式:負離子;色譜柱:Inertsil ODS-3(4.6 mm×150 mm,5μm);流動相:10%乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液;流速:1 m L·min-1; UV檢測器:280 nm;MS檢測器:MS2 scan,product scan,collision energy 5V。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)路線的選擇

在歐洲藥典中,有關(guān)物質(zhì)G又稱為N-Succinyltyrosine[6],該物質(zhì)中含有L-酪氨酸和琥珀酸的結(jié)構(gòu),其中L-酪氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中屬于常見物質(zhì),琥珀酸是細胞代謝三羧酸循環(huán)中的重要物質(zhì)[7,8],二者有可能在某種酶的催化下形成酰胺鍵進而生成有關(guān)物質(zhì)G,因此推測有關(guān)物質(zhì)G極可能是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的?；瘜W(xué)合成中常用的酰胺鍵生成方法有酸酐法和酰氯法[9]。

研究表明,作為?；瘎r酸酐的活性比相應(yīng)的酰鹵弱,反應(yīng)速度比酰鹵慢[9]。但本研究中對比兩種合成方法發(fā)現(xiàn),酰氯法的反應(yīng)時間比酸酐法要長很多,有關(guān)物質(zhì)G的純度和收率也比酸酐法低,經(jīng)過多次實驗對酰氯法合成條件進行調(diào)整后,有關(guān)物質(zhì)G的最高純度為52.6%,總收率為46.0%;而酸酐法合成的有關(guān)物質(zhì)G粗品純度達到87.4%,收率為85.7%。因此,選擇酸酐法作為合成有關(guān)物質(zhì)G的路線。

2.2 反應(yīng)溶劑的選擇

由于L-酪氨酸的溶解性較差,所以選擇合適的反應(yīng)溶劑很關(guān)鍵。在堿性條件下有利于氨基酸類物質(zhì)?；磻?yīng)的進行[10],首先選擇水、二甲基甲酰胺、二甲苯、氯仿等作為溶劑,結(jié)果均沒有有關(guān)物質(zhì)G生成;L-酪氨酸易溶于甲酸,因而選用甲酸作為溶劑,雖然有有關(guān)物質(zhì)G生成,但反應(yīng)副產(chǎn)物很多,純度最高僅能達到40%;進而選用冰醋酸作為溶劑,L-酪氨酸和琥珀酸酐反應(yīng)較為充分,合成有關(guān)物質(zhì)G的含量較高。因此,最終選擇冰醋酸作為反應(yīng)溶劑。

2.3 反應(yīng)物料配比對反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度為95℃、反應(yīng)時間為1.0 h的條件下,考察反應(yīng)物料配比(L-酪氨酸和琥珀酸酐摩爾比,下同)對有關(guān)物質(zhì)G收率和純度的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)物料配比對有關(guān)物質(zhì)G收率和純度的影響Fig.4 Effect of reactants ratio on yield and purity of the related substance G

從有關(guān)物質(zhì)G的結(jié)構(gòu)上分析,琥珀酸酐和L-酪氨酸的反應(yīng)摩爾比為1∶1。但是由于琥珀酸為二元酸,若L-酪氨酸過量,則有可能與L-酪氨酸形成2個酰胺鍵,生成較多的副產(chǎn)物。而琥珀酸酐過量則有利于與L-酪氨酸形成1個酰胺鍵,生成較多的有關(guān)物質(zhì)G,同時使L-酪氨酸反應(yīng)更充分。但琥珀酸酐過量太多,則會有大量的琥珀酸酐未反應(yīng)造成浪費,同時也不利于后期純化。由圖4可知,物料配比為1∶1.5時,有關(guān)物質(zhì)G粗品的收率最高,達到85.7%,純度達到87.4%。因此,選擇適宜的物料配比為1∶1.5。

2.4 反應(yīng)溫度對反應(yīng)的影響

在物料配比為1∶1.5、反應(yīng)時間為1.0 h的條件下,考察反應(yīng)溫度對有關(guān)物質(zhì)G收率和純度的影響,結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)溫度對有關(guān)物質(zhì)G收率和純度的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on yield and purity of the related substance G

雖然很多酰化反應(yīng)屬于放熱反應(yīng)[11],低溫條件下有利于反應(yīng)向所期望的方向進行。但由于L-酪氨酸的溶解性較差,導(dǎo)致其在反應(yīng)溶劑中的濃度很低,反應(yīng)速度很慢,因此需要升高反應(yīng)溫度以加快反應(yīng)速度。由圖5可知,隨著反應(yīng)溫度的升高,反應(yīng)速度加快,有關(guān)物質(zhì)G的收率逐漸上升,在95℃時達到最高;但反應(yīng)溫度過高,超過95℃后容易引起副反應(yīng)發(fā)生,導(dǎo)致副產(chǎn)物增多,有關(guān)物質(zhì)G的收率和純度反而下降。因此,選擇適宜的反應(yīng)溫度為95℃。

2.5 反應(yīng)時間對反應(yīng)的影響

在物料配比為1∶1.5、反應(yīng)溫度為95℃的條件下,考察反應(yīng)時間對有關(guān)物質(zhì)G收率和純度的影響,結(jié)果如圖6所示。

圖6 反應(yīng)時間對有關(guān)物質(zhì)G收率和純度的影響Fig.6 Effect of reaction time on yield and purity of the related substance G

由圖6可知,反應(yīng)時間為0.5 h時,反應(yīng)時間太短,反應(yīng)不充分,有關(guān)物質(zhì)G的收率和純度分別只有40.9%、41.3%;當反應(yīng)時間為1.0 h時,收率和純度最高,分別為85.7%、87.4%;而反應(yīng)時間過長時,副產(chǎn)物增加,收率和純度反而下降,如反應(yīng)4.0 h時的收率和純度分別為35.6%、41.2%。因此,選擇適宜的反應(yīng)時間為1.0 h。

2.6 液相色譜分析

酸酐法合成有關(guān)物質(zhì)G的粗品最高純度為87.4%,含有較多雜質(zhì),其液相色譜見圖7a。利用制備液相色譜[12]對有關(guān)物質(zhì)G粗品進行純化,純化后的有關(guān)物質(zhì)G的液相色譜見圖7b。

由圖7可知,純化后的有關(guān)物質(zhì)G的譜峰單一,經(jīng)計算純度為99.6%。經(jīng)統(tǒng)計分析,酸酐法合成有關(guān)物質(zhì)G的總收率為68.6%。

2.7 LC-MS/MS結(jié)構(gòu)鑒定

采用LC-MS/MS對合成的物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定,其二級質(zhì)譜譜圖如圖8所示。

經(jīng)LC-MS/MS分析,所合成物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與歐洲藥典中標示的克拉維酸鉀中有關(guān)物質(zhì)G(4-[[1-Carboxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]amino]-4-oxobutanoic acid)的化學(xué)結(jié)構(gòu)相符,即該物質(zhì)為N-琥珀酰酪氨酸(N-Succinyltyrosine)。

圖7 有關(guān)物質(zhì)G粗品(a)和純品(b)的液相色譜Fig.7 The chromatograms of crude product(a)and pure product(b)of the related substance G

有關(guān)物質(zhì)G的可能裂解路徑及產(chǎn)物離子的可能結(jié)構(gòu)見圖9。

圖8 特征離子m/z280的二級質(zhì)譜圖Fig.8 Two stage mass spectrum of characteristic ions m/z280

圖9 特征離子m/z280的可能裂解路徑及可能的結(jié)構(gòu)Fig.9 Predicted cracking path and possible structure of characteristic ions m/z280

3 結(jié)論

(1)以L-酪氨酸和琥珀酸酐為原料、氯化鋰為催化劑、冰醋酸為溶劑合成了克拉維酸鉀中有關(guān)物質(zhì)G,在L-酪氨酸和琥珀酸酐的摩爾比為1∶1.5、95℃加熱反應(yīng)1.0 h的優(yōu)化條件下,有關(guān)物質(zhì)G粗品的最高純度達到87.4%,收率為85.7%。

(2)經(jīng)高效制備液相色譜純化,有關(guān)物質(zhì)G的純度達到99.6%,總收率為68.6%。

(3)通過LC-MS/MS表征,確定合成產(chǎn)物為歐洲藥典標示的克拉維酸鉀中有關(guān)物質(zhì)G。

(4)該方法可以較大規(guī)模地制備有關(guān)物質(zhì)G,便于對其性質(zhì)進行研究,進而降低該物質(zhì)在克拉維酸鉀中的含量,最終提高克拉維酸鉀的產(chǎn)品質(zhì)量。

[1] Aharonowitz Y,Demain A L.Carbon catabolite regulation of cephalosporin production in Streptomyces clavuligerus[J].Antimicrob Agents Chemother,1978,14(2):159-164.

[2] Haginaka Jun,Nakagawa Terumichi,Toyozo Uno.Stability of clavulanic acid in aqueous solutions[J].Chem Phara Bull,1981,29 (11):3334-3341.

[3] Saudagar P S,Survase S A,Singhal R S.Clavulanic acid:A review [J].Biotechnology Advances,2008,26(4):335-351.

[4] 劉寶樹,王靜康,龔俊波,等.克拉維酸鉀反應(yīng)結(jié)晶研究[J].中國抗生素雜志,2005,30(11):656-698.

[5] Yu Yihua,Ye Lei,de Biasi Vern,et al.Removal of the fermentation by-product succinyl L-tyrosine from theβ-lactamase inhibitor clavulanic acid using a molecularly imprintde polymer[J].Biotechnology and Bioengineering,2002,79(1):23-28.

[6] European Pharmacopoeia 5.0,2278-2279.

[7] 王鏡巖,朱圣庚,徐長法.生物化學(xué)(第三版下冊)[M].北京:高等教育出版社,2002:97-98.

[8] 管桂萍,王紅兵,田杰生.琥珀酸對產(chǎn)酸克雷伯氏菌好氧發(fā)酵甘油產(chǎn)1,3-丙二醇的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(5):23-27.

[9] 黃憲,王彥廣,陳振初.新編有機合成化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:472-477.

[10] 胡宏紋.有機化學(xué)[M].北京:高等教育出版社,1990:662-664.

[11] 龔報森.有機化學(xué)實驗[M].西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社,1998: 140-141.

[12] 王學(xué)軍,趙鎖奇,王仁安.制備色譜技術(shù)進展[J].青島大學(xué)學(xué)報, 2001,16(4):92-94.

Chemical Synthesis and Structural Identification of the Related Substance G in Clavulanate Potassium

CHEN Fang1,JIN Xiao-qing1,CAO Guang-xiang1,ZHANG Xiao-xiao1,WANG Shan-shan2,ZHONG Chuan-qing2
(1.Research and Development Department of Lunan Pharmaceutical Group,Linyi 276000,China; 2.School of Municipal and Environmental Engineering,Shandong Jianzhu University,Jinan 250101,China)

The related substance G in clavulanate potassium was synthesized from L-tyrosine and succinic anhydride in glacial acetic acid with lithium chloride as catalyst.Effects of type of reaction solvent,reactants ratio,reaction temperature and reaction time on the yield and purity of the related substance G were studied.Under the optimum conditions as follows:the molar ratio of L-tyrosine to succinic anhydride was 1∶1.5,the reaction temperature was 95℃,the reaction time was 1.0 h,,the purity and yield of the related substance G reached 87.4%and 85.7%,respectively.Preparative liquid chromatography was used for purification,while the purity reached 99.6%and the total yield reached 68.6%.The structure of the substance synthesized was proved to be the same as that of the related substance G in European Pharmacopoeia by LC-MS/MS.

clavulanic acid;related substance G;chemical synthesis;structural identification

R 978.11

A

1672-5425(2013)01-0084-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.01.22

2012-08-14

陳仿(1982-),女,江蘇邳州人,助理工程師,研究方向:生物制藥工程;通訊作者:鐘傳青,博士,副教授,E-mail:zhongchq @163.com。