延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 （延安716000） 米志寬 趙菊梅 劉勇峰 王愛(ài)紅

碘伏是碘與表面活性劑及增強(qiáng)劑形成的碘的復(fù)合物，是手術(shù)室常用的消毒劑，用于手術(shù)前手消毒和手術(shù)部位皮膚、粘膜的消毒，有效碘含量0．45%～0．55%，可殺滅腸道致病菌、化膿性致病菌、對(duì)芽孢和病毒也有殺傷作用，由于它無(wú)刺激性、無(wú)致敏性、滲透性強(qiáng)、藥效持久、作用快速的特點(diǎn)，是清創(chuàng)消毒、預(yù)防感染理想的藥液［1］。近幾年來(lái)，其臨床應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，還用于治療口腔疾病、腳癬、婦科疾病等［2～4］。碘伏是否對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，國(guó)內(nèi)報(bào)道鮮見(jiàn)。本研究用稀釋的碘伏處理結(jié)腸癌細(xì)胞，觀察其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。

材料與方法

1 細(xì)胞株和主要試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480為延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）購(gòu)于美國(guó)sig ma公司，RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FCS）及細(xì)胞消化液胰酶（Tyrisin）購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司。熒光顯微鏡及CCD采用Nikon顯微鏡，酶標(biāo)儀采用美國(guó)Bio－Rad 680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀。碘伏購(gòu)于西安潔士衛(wèi)生保健用品有限責(zé)任公司（有效碘濃度為0．5%），臨用前用RPMI－1640培養(yǎng)基將碘伏稀釋成所需濃度。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮罐中取出SW480細(xì)胞株，迅速置于37℃水浴融化，離心去掉凍存液，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶，按常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，0．1 mg/ml鏈霉素的 RPMI－1640培養(yǎng)基中，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．2 MTT法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞以5×104/ml的密度接種于96孔板中，每孔200μl。次日細(xì)胞貼壁后，更換含有碘伏的培養(yǎng)基，其終濃度分別為0．05%、0．025%、0．01%，每個(gè)濃度設(shè)四個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)四個(gè)復(fù)孔加入含血清的RPMI－1640培養(yǎng)基為對(duì)照組，于培養(yǎng)1、3、5 min后加入 MTT20μl/孔（5 mg/ml），繼續(xù)孵育4h，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO）150μl/孔，充分混勻，在酶標(biāo)儀570n m處測(cè)其吸光度（A）值，計(jì)算平均A值和抑制率（IR）。試驗(yàn)重復(fù)3次。

IR＝［1－（實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）］×100%。

2．3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞以2×105/ml的密度接種于6孔板中，每孔2 ml。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%，更換含0．01%碘伏的培養(yǎng)基，作用1 min后，在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。

2．4 PI染色：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞以2×105/ml的密度接種于6孔板中，每孔2 ml。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%，更換含0．01%碘伏的培養(yǎng)基，作用1 min后，吸棄培養(yǎng)基，并用PBS清洗3次，加固定液0．5 ml，4℃冰箱過(guò)夜，吸棄固定液，PBS洗滌2次，每次3 min，吸盡液體加入1 ml/孔PI應(yīng)用液，避光放置30 min，吸棄染液，加一滴熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

結(jié) 果

1 稀釋碘伏對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響：用不同濃度碘伏處理細(xì)胞后，細(xì)胞增殖明顯被抑制，各處理組與對(duì)照組相比均有差異性（P＜0．05），但時(shí)間和劑量依賴關(guān)系不明顯，見(jiàn)附表。

圖2 0．01%稀釋碘伏處理SW480后PI染色的形態(tài)學(xué)改變（×200）

2 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化：0．01%稀釋碘伏作用于SW480細(xì)胞1 min后，倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，活細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓，細(xì)胞膜皺縮，折光性小，部分細(xì)胞脫落（圖1）。

3 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察：PI染色后觀察到對(duì)照組SW480活細(xì)胞染成紅色，核呈正常結(jié)構(gòu)；凋亡細(xì)胞染成紅色，核呈固縮狀或圓珠狀，可見(jiàn)明顯的染色質(zhì)凝集；壞死細(xì)胞染成紅色，核呈均勻著色（圖2）。

附表 稀釋碘伏對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響（，n＝12）

附表 稀釋碘伏對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響（，n＝12）

＃與對(duì)照組相比，P＜0．05

碘伏濃度1 min吸光度 IR（%）3 min吸光度 IR（%）5 min吸光度 IR（%）0 1．128±0．049 1．131±0．072 1．133±0．070 0．01% 0．199±0．003＃ 82．4 0．186±0．006＃ 83．6 0．182±0．004＃ 84．0 0．025% 0．188±0．008＃ 83．3 0．181±0．008＃ 84．0 0．178±0．003＃ 84．3 0．05% 0．184±0．005＃ 83．7 0．177±0．006＃ 84．4 0．176±0．006＃84．5

討 論

結(jié)腸癌在我國(guó)屬低發(fā)地區(qū)，但隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，環(huán)境因素與飲食習(xí)慣的改變，我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率與病死率有逐年上升的趨勢(shì)［5］。結(jié)腸癌主要采用以手術(shù)治療為主的綜合治療，但許多患者仍有較高的復(fù)發(fā)率，術(shù)后5年生存率為60%～80%，死亡原因主要為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［6］。故探索較好的預(yù)防術(shù)中和術(shù)后轉(zhuǎn)移的方法是非常必要的。腹腔灌洗是預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的措施之一。對(duì)118位普外科大夫的問(wèn)卷調(diào)查表明，47%的人用生理鹽水作為腹腔灌洗液、38%用稀釋碘、9% 用無(wú)菌水、3%使用抗生素，但灌洗液的使用量還不確定［7］。Favoulet等［8］應(yīng)用大鼠建立了結(jié)腸癌的腹腔轉(zhuǎn)移模型，探討碘伏對(duì)結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移的抑制作用，結(jié)果表明1%稀釋碘可以抑制結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移灶的形成，并取得了良好的效果。Opitz等［9］研究了?；橇_定和稀釋碘伏對(duì)惡性胸膜間皮瘤作用，發(fā)現(xiàn)兩種藥物能不同程度地殺傷腫瘤細(xì)胞，前者引起了細(xì)胞壞死性死亡，后者誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，兩個(gè)都有望成為局部治療胸膜間皮瘤的理想藥物。毒理學(xué)試驗(yàn)表明，碘伏消毒液對(duì)大、小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)屬實(shí)際無(wú)毒，對(duì)兔皮膚和兔眼均屬無(wú)刺激性；小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性，說(shuō)明其毒性比較低，對(duì)皮膚黏膜刺激性?。?0］。

本實(shí)驗(yàn)使用稀釋碘伏處理結(jié)腸癌細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度稀釋碘伏在短時(shí)間內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖均具有明顯抑制作用，在六孔培養(yǎng)板中接種結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，用0．01%的稀釋碘伏處理細(xì)胞1 min后，在光鏡下觀察到細(xì)胞發(fā)生了明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓，細(xì)胞膜皺縮，折光性小，部分細(xì)胞脫落，隨后用PI染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)處理組細(xì)胞皺縮，胞核濃縮、裂解、脫落，與對(duì)照組相比變化明顯。本實(shí)驗(yàn)表明，0．01%的稀釋碘伏明顯抑制體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0．01%的稀釋碘伏對(duì)體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞SGC－7901具有明顯的抑制作用［11］。故胃癌和結(jié)腸癌手術(shù)關(guān)腹前用稀釋碘伏腹腔灌洗浸泡，利用碘伏解聚緩慢釋放出的活性碘消滅腹腔殘留和脫落的癌細(xì)胞，可能對(duì)胃癌和結(jié)腸癌手術(shù)后腹腔種植轉(zhuǎn)移的預(yù)防有一定的作用。

［1］陳新謙，金有緣．新編藥理學(xué)［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1587．

［2］Hoang T，Jorgensen MG，Keim RG，et al．Povidone–iodine as a periodontal pocket disinfectant［J］．J Periodontal Res，2003，38：311–317．

［3］Ripa S，Br uno N，Reder RF，et al．Clinical applications of povidone－iodine as a topical anti microbial．In Handbook of topical anti micr obials：industrial applications in consu mer products and phar maceuticals edited by：Paulson DS．New York：Marcel Dekker，2003：77－98．

［4］Rei mer K，Wichelhaus TA，Schafer V，et al．Anti microbial effectiveness of povidone－iodine and consequences for new application areas［J］．Der matology，2002，204：114–20．

［5］Par kin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al．Global cancer statistics，2002［J］．Cancer J Clin，2005，55（2）：74－108．

［6］Troisi RJ，F(xiàn)reed man A N，Devesa SS．Incidence of colorectal carcino ma in the US：An update of trends by gender，race，age，subsite，and stage，1975－1994［J］．Cancer，1999，85：1670－1676．

［7］Whiteside OJH，Tytherleigh MG，Thrush S，et al．Intra－operative peritoneal lavage－who does it and why［J］．Ann R Coll Surg Engl，2005，87（4）：255－258．

［8］Favoulet P，Benoit L，Guiu B，et al．Evaluation of povidone abdo minal washing for prevention of peritoneal cancer cell seeding：experi mental study in the rat［J］．Ann Chir，2002，127（8）：600－605．

［9］Opitz I，Sigrist B，Hillinger S，et al．Taurolidine and povidone－iodine induce different types of cell deat h in malignant pleural mesothelioma［J］．Lung Cancer，2007，56（3）：327－336．

［10］張紫虹，楊美玲，胡永成，等．聚維酮碘消毒液的毒性研究［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（8）：1641－1643．

［11］趙菊梅，劉勇峰，陳美霓，等．稀釋碘伏對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC－7901生長(zhǎng)的影響［J］．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42（4）：285－288．