鄒曉燕 張洪武

(1.中國科學院城市環(huán)境研究所, 廈門 361021; 2.中國科學院大學, 北京 100049)

微生物易于實驗控制, 已逐漸成為評價化學物質對水生態(tài)系統(tǒng)刺激效應的模式生物[1]。四膜蟲(Tetrahymena pyriformis)是一種單細胞真核生物, 廣泛存在于自然環(huán)境中, 是水生態(tài)健康的重要評價指標之一[2,3]。由于四膜蟲繁殖迅速, 在最適條件下大約每 2.5—3h可以分裂一次;只需進行無菌培養(yǎng), 就能得到數(shù)量較多的實驗材料, 被廣泛應用于細胞生物學、遺傳學、生物化學及分子生物學[4—6], 在基礎研究中一直處于前沿地位[7]。目前在毒性測試過程中,常用于評價四膜蟲毒性效應的方法有血小板計數(shù)法[8]、自動細胞計數(shù)儀法[9]、比濁法[9]、干重法、生物熒光法等。血小板計數(shù)法過程繁瑣、耗時長、重復性差, 不能及時反應四膜蟲的生物情況, 不適合檢測大批量樣品; 而其他方法不能區(qū)分細胞的死活?？扇苄脏邕蛩{(WST-8)是一種類似于四甲基噻唑藍(MTT)的化合物, 在電子耦合試劑存在的情況下, 可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚[10]。與傳統(tǒng)MTT比色法相比, 不必洗滌細胞和收集細胞, 也不必采用額外的步驟去溶解甲瓚, 適合大批量樣品的檢測。此外, WST-8法目前多用于免疫細胞的檢測[11,12], 很少用于檢測微生物的細胞活性。本研究用WST-8比色法檢測梨形四膜蟲的細胞活性, 并將結果與常規(guī)計數(shù)法進行比較。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

GL-C梨形四膜蟲(T.pyriformis)由中國科學院城市環(huán)境研究所楊軍課題組提供。在 30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24—30h。

PPYS培養(yǎng)基： 0.5%葡萄糖, 0.25%酵母浸粉, 0.25%胰蛋白胨, 25 mL分裝于 100 mL三角瓶中, 120℃滅菌30min, 冷卻備用。葡萄糖購置汕頭市達濠精細化學品公司, 酵母浸粉和胰蛋白胨購置北京索萊寶科技有限公司(Beijing solarbio science & Technology Co., Ltd.), 上述試劑均為AR純, 整個實驗過程均使用超純水配制。

1.2 試劑

CCK-8(Cell Counting Kit-8)試劑盒(含 WST-8試劑)購置碧云天生物技術研究所; 固定液： 用pH 7.2 PBS緩沖液將 25%戊二醛稀釋至 3.0%; 玻璃儀器在使用前均用10%硝酸浸泡48h, 并用超純水沖洗干凈。

1.3 WST-8比色法測定

將不同濃度梯度的四膜蟲培養(yǎng)液加入96孔板, 每孔100 μL, 各做三個平行, 然后每孔加入10 μL WST-8試劑,30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 0.5、1、2、3、4、5和 6h后取出, 用酶標儀測定450 nm下的吸光值(A450)。

1.4 常規(guī)計數(shù)法測定

取不同濃度梯度的四膜蟲培養(yǎng)液300 μL, 加入25 μL 3.0%固定液, 混勻。然后用血球計數(shù)板計數(shù), 每個樣品鏡檢3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實驗結果重復三次, 結果用(均值±標準偏差)表示, 利用Origin8.0對其進行線性回歸相關性分析。

2 結果

2.1 WST-8添加量對空白值的影響

從圖 1中可以看出, 隨著 WST-8加入量的增加, 背景空白越高, 當WST-8加入量達到20 μL時, 培養(yǎng)基空白達到 0.201±0.003, 該值遠超樣品的檢測結果; 當 WST-8加入量為 5 μL時, 雖然空白值較低, 但其相對標準偏差RSD較大(RSD5μL=15.2%,RSD10μL=3.5%,RSD20μL=1.9%。從空白值考慮, 該檢測方法WST-8最適加入量為10 μL。

2.2 WST-8的培養(yǎng)時間

圖2結果顯示樣品吸光度A450隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增加。樣品加入WST-8培養(yǎng)4h后其A450基本保持不變,變化率小于5.0%/h。

2.3 不同濃度對WST-8法檢測結果的影響

圖1 不同劑量WST-8對空白值的影響Fig.1 The effect of different dosage WST-8 on blank values

圖2 不同培養(yǎng)時間對吸光度A450值的影響Fig.2 Effect of different inoculation time on A450

圖3表示不同濃度對檢測結果的影響。接種量在2%—32%范圍內時,A450隨接種量增加而增大。接種量越大,加入WST-8后培養(yǎng)時間對檢測結果影響越明顯。接種量越大, 四膜蟲培養(yǎng)時間越長, 即四膜蟲細胞密度越大, 檢測結果的誤差越大。四膜蟲接種量為32%和40%, 四膜蟲培養(yǎng)27h后 WST-8法檢測結果的相對標準偏差RSD達到25.8%和41.2%。

2.4 WST-8法與常規(guī)計數(shù)法檢測結果比較

圖5結果顯示, 四膜蟲接種量在 2%—24%范圍內,WST-8與計數(shù)法的檢測結果均隨四膜蟲接種量的增加而逐漸加大,A450與四膜蟲細胞數(shù)之間的相關系數(shù)R=0.879,經SPSS統(tǒng)計分析P<0.01, 說明兩種檢測方法結果呈極顯著正相關。接種量越大, WST-8與計數(shù)法的檢測結果相關性越弱。這是因為 WST-8法檢測的是活細胞的數(shù)目, 接種量越大, 相同時間內死亡的四膜蟲數(shù)量也越多,A450越小, 但四膜蟲絕對細胞數(shù)卻是增加的。從圖5a可以看出,接種量達到40%時,A450值明顯低于接種量為32%的樣品;圖5b接種量達到40%時,A450值與接種量為32%的樣品相當, 這是因為在營養(yǎng)物質充足的情況下, 接種量大的四膜蟲樣品進入了新的生長周期, 細胞增殖, 活細胞數(shù)目增加,A450值增大。

2.5 用 WST-8方法檢測五價砷(As(Ⅴ))對梨形四膜蟲的毒性效應

圖3 接種量對A450值的影響(A.四膜蟲培養(yǎng)24h; B.四膜蟲培養(yǎng)27h)Fig.3 Effect of different inoculation amount on A450 (A.24h after incubation; B.27h after incubation)

圖4 不同接種量對相對標準偏差RSD的影響(加入WST-8后培養(yǎng)時間為4h)Fig.4 Effect of different inoculation amount on relative standard deviation (4h after adding WST-8)

圖5 常規(guī)計數(shù)法與WST-8法結果比較(A.四膜蟲培養(yǎng)24h;B.四膜蟲培養(yǎng)27h)Fig.5 Results comparison using conventional counting method and WST-8 colorimetric method(A.24h after incubation; B.27h after incubation)

圖6分別用計數(shù)法和WST-8法檢測As(Ⅴ)對四膜蟲的毒性效應。計數(shù)法和WST-8法檢測結果具有相同的變化趨勢, 即低濃度As(Ⅴ)能夠促進四膜蟲的生長, 高濃度As(Ⅴ)抑制四膜蟲生長。原因可能是低濃度外源物質可引起生物體應急反應, 但濃度過高則產生毒性, 抑制生物體生長發(fā)育和細胞活性[6]。兩種檢測方法對應的半效應濃度EC50分別為1.21 mg/L和0.88 mg/L。

3 討論

圖6 As(Ⅴ)對四膜蟲的毒性效應Fig.6 Toxic effect of As(Ⅴ) on T.pyriformis

眾所周知, WST-8是一種類似于MTT的顯色劑, 可以檢測細胞存活和生長[9], 活細胞內的脫氫酶能還原WST-8形成橙黃色晶體, 細胞增殖越多越快, 則顏色越深; 細胞毒性越大, 則顏色越淺, 采用酶標儀在 450 nm處測其吸光度可間接反應活細胞的數(shù)量。但是當體系中存在影響細胞生長的因素時, 常會影響實驗結果造成實驗數(shù)據(jù)誤差。本實驗通過空白背景值的比較, 確定 WST-8最適加入量為10 μL, 對加入 WST-8后的培養(yǎng)時間比較,確定最佳培養(yǎng)時間為4h。接種量在2%—24%范圍內, 計數(shù)法與 WST-8法檢測結果呈極顯著正相關(R=0.879,P<0.01), WST-8法在此范圍內檢測結果的相對標準偏差約為10%, 具有較好的重現(xiàn)性。用計數(shù)法和 WST-8法檢測As(Ⅴ)對四膜蟲的毒性, 結果具有相同的變化趨勢, 半效應濃度分別為1.21和0.88 mg/L, 這說明計數(shù)法的統(tǒng)計結果包括已死亡的四膜蟲, 故使其獲得的半效應濃度值高于WST-8法。WST-8法能夠更準確地反應出As(Ⅴ)對四膜蟲的毒性效應。

在有關微生物的工作中對其生長及活性的評價是非常重要的。用常規(guī)計數(shù)法統(tǒng)計毒物對四膜蟲的毒性時, 死亡細胞和存活細胞常常難以區(qū)分, 一般是通過檢測人員的經驗進行主觀判斷, 涂板過程工作量大。采用 WST-8法只需將 WST-8試劑按一定比例加入到細胞培養(yǎng)板中,經過一定時間培養(yǎng), 活細胞即可將 WST-8代謝為黃色的水溶性甲瓚染料, 直接在450 nm波長處測定。與常規(guī)計數(shù)法相比, WST-8法減少計數(shù)過程人為的主觀誤差, 大大減輕了工作量, 結果顯示為活細胞的數(shù)量或微生物細胞的活性, 具有傳統(tǒng)計數(shù)法所無法比擬的優(yōu)點。WST-8法可以快速、簡便地分析四膜蟲的細胞活性。

致謝：

四膜蟲的培養(yǎng)得到了中國科學院城市環(huán)境所楊軍研究員以及張永雨副研究員的指導和幫助。

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