彭 方 王 茜 王 蘭

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006)

溴氰菊酯(Deltamethrin, DM)屬常用擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑, 由于其低毒性和易分解性, 目前被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)蟲(chóng)害的控制[1,2]。由于雨水、河流的沖刷, DM會(huì)隨水流進(jìn)入江河、湖泊。雖然這種農(nóng)藥最初被認(rèn)為是無(wú)毒的, 但是目前大量研究證明了它的毒性[3—6]。因此, 溴氰菊酯在水環(huán)境中的殘留量以及對(duì)水生生物的毒性作用已經(jīng)成為許多研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。

Iqbal Sayeed, et al.[7]用溴氰菊酯染毒淡水魚(yú)(Channa punctatus Bloch), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯可以引起其鰓、肝胰腺和腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化酶水平的升高。胡瓊予等[8]研究了溴氰菊酯對(duì)鯽魚(yú)(Carassius auratus)的毒性效應(yīng), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)DM 會(huì)對(duì)鯽魚(yú)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase, GST)活性產(chǎn)生影響, 并且會(huì)引起蛋白質(zhì)和DNA的交聯(lián)反應(yīng)。研究表明[9,10], 溴氰菊酯對(duì)水生生物的毒性為高毒, 特別是浮游生物, 其對(duì)溴氰菊酯的敏感性順序依次為枝角類>橈足類>原生動(dòng)物>輪蟲(chóng)[11]。 多刺裸腹 溞隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、枝角類, 生活周期短、易采集、分布廣、實(shí)驗(yàn)室條件下可進(jìn)行穩(wěn)定的孤雌生殖[12,13]。本實(shí)驗(yàn)選用太原市的優(yōu)勢(shì)種群多刺裸腹 溞(Moina macrocopa)作為實(shí)驗(yàn)材料, 通過(guò)研究溴氰菊酯脅迫對(duì)其急性毒性, 體內(nèi)丙二醛(MDA)含量及3種解毒代謝酶(細(xì)胞色素P450、GST和GPX)活力的影響, 分析溴氰菊酯對(duì)枝角類的毒性作用,并篩選靈敏的生化指標(biāo)用于反映水環(huán)境中DM的污染狀況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

多刺裸腹 溞(以下簡(jiǎn)稱“裸腹溞”), 采自山西省太原市小店區(qū)二里河, 在實(shí)驗(yàn)室 20—25℃水溫條件下培養(yǎng),經(jīng)過(guò)三代以上孤雌生殖, 敏感度測(cè)試達(dá)到了中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)、物質(zhì)對(duì) 溞類(大型溞)急性毒性測(cè)定方法》(GB/T13266-91)[14]。實(shí)驗(yàn)用為1 日齡幼 溞。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

溴氰菊酯(濃度：25 g/L)為南京紅太陽(yáng)有限公司生產(chǎn)的乳油制劑, 根據(jù)其有效成分用蒸餾水配制成農(nóng)藥儲(chǔ)備液, 實(shí)驗(yàn)時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋成所需的不同濃度使用。細(xì)胞色素P450酶系總活性熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因試劑公司。MDA、GPX、GST和考馬斯亮藍(lán)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax M5, California, USA)、恒溫金屬浴(CHB100, CHNIA)、電子分析天平(Model ESJ120-4)、冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific Jouan MR23i)、?80℃低溫冰箱(Thermo, Fofma 702 Series, USA)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

急性毒性 選取生長(zhǎng)狀況良好的強(qiáng)壯1 日齡幼 溞,分別接種到盛有不同濃度溴氰菊酯(0、0.006、0.013、0.025、0.050、0.100 μg/L)溶液的燒杯(250 mL)中, 每個(gè)燒杯10只, 設(shè)三組平行三次重復(fù), 24、48h后按心臟停止跳動(dòng)為裸腹 溞死亡終點(diǎn), 分別統(tǒng)計(jì)各濃度組的死亡率。

酶活的測(cè)定 根據(jù)溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹 溞24h半致死濃度(LC50)1/32、1/16、1/8、1/4和1/2, 設(shè)置5個(gè)溴氰菊酯濃度組和對(duì)照組, 處理時(shí)間為12h和24h。選取同一條件下培養(yǎng)的 1 日齡幼 溞同一時(shí)間進(jìn)行染毒, 設(shè)三組平行三次重復(fù), 染毒處理完畢后, 使用200 目濾網(wǎng)將水溞過(guò)濾, 雙蒸水迅速清洗殘留毒液, 用濾紙吸干多余水分,放入1.5 mL的EP管后置于液氮罐中。取樣完畢后將液氮罐中的材料放入?80℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)加入 pH 7.2 PBS溶液冰凍勻漿, 勻漿液經(jīng)4℃ 3500 g 離心10min后取上清, 待測(cè)。 采用TBA顯色法測(cè)定丙二醛(MDA)含量,熒光法定量測(cè)定樣品中細(xì)胞色素 P450酶系總活性(CYP-ECOD)活性, CDNB法測(cè)定GST活性, DNTB法測(cè)定GPX活性, 蛋白質(zhì)含量采用 Bradford方法[15], 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。利用美國(guó) MD公司 SpectraMax M5酶標(biāo)儀進(jìn)行活力和含量的測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

24h和 48h LC50采用概率單位法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 結(jié)果采用單因素方差分析(One-Way ANOVA), 并應(yīng)用 Dunnett 法將處理組和對(duì)照組進(jìn)行比較分析,與對(duì)照組比較, P<0.05為差異顯著, P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹溞的急性毒性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn), 不同濃度(0、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00 μg/L)溴 氰菊酯染毒多刺裸腹 溞24h、48h后, 溞體的死亡率表現(xiàn)出隨處理濃度的增大及處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)。在 實(shí)驗(yàn)中觀察到多刺裸腹 溞中毒癥狀主要表現(xiàn)為：游動(dòng)緩慢、外殼膨脹發(fā)白、觸角擺動(dòng)變慢。通過(guò)概率單位法求得溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹 溞24h、48h LC50分別為0.210、0.184 μg/L(表 1)。

2.2 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹溞脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響

隨著溴氰菊酯處理濃度和時(shí)間的增加, MDA含量也隨之升高(圖1)。在12、24h, 濃度為0.006 μg/L時(shí), MDA含量較對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05)。在0.013—0.100 μg/L各個(gè)濃度組處理 12、24h后, MDA含量均顯著上升(P<0.05)。其中, 0.100 μg/L濃度組處理24h后, 機(jī)體MDA含量上升至最大值, 與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.3 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹溞CYP-ECOD的影響

溴氰菊酯染毒后, 各處理組CYP-ECOD活性受到不同程度的影響(圖2)。當(dāng)DM濃度為0.006 μg/L, 處理12、24h后, CYP-ECOD活性較正常組開(kāi)始顯著升高(P<0.05),當(dāng)濃度升高為 0.013 μg/L, 兩個(gè)時(shí)間段 CYP-ECOD活性較對(duì)照組極顯著升高(P<0.01)。隨著染毒濃度和處理時(shí)間的增加, 在濃度為 0.100 μg/L, 染毒 12h后, CYP-ECOD較對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05), CYP-ECOD活性恢復(fù)到正常組水平。

2.4 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹 溞GST活力的影響

在不同濃度溴氰菊酯作用后, GST活力呈現(xiàn)低促高抑的變化規(guī)律(圖3)。0.006 μg/L濃度處理12、24h, 裸腹溞 GST活力較對(duì)照組顯著上升(P<0.05)。0.013—0.050 μg/L各個(gè)濃度組處理12、24h, GST活力極顯著上升(P<0.01)。而DM濃度升高為0.100 μg/L, 處理24h后, GST活力較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。

表1 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹溞24h、48h LC50Tab. 1 LC50 of deltamethrin for Moina macrocopa in 24 and 48 hours

圖1 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹 溞MDA含量的影響Fig. 1 Effects of Deltamethrin on MDA contention in M. macrocopa

圖2 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹 溞CYP-ECOD活性的影響Fig. 2 Effects of Deltamethrin on CYP-ECOD activity in M.macrocopa

2.5 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹溞GPX活力的影響

在低濃度溴氰菊酯0.006、0.013 μg/L 處理裸腹 溞12、24h 后, GPX活力隨著濃度的增加與正常組相比有升高的趨勢(shì)(圖 4), 0.025 μg/L 濃度處理 12、24h 和 0.050 μg/L處理12h后, GPX活力表現(xiàn)為極顯著上升(P<0.01), 但當(dāng)溴氰菊酯濃度升高為0.100 μg/L時(shí), GPX活力較對(duì)照組極顯著下降(P<0.01)。

圖3 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹 溞GST活性的影響Fig. 3 Effects of Deltamethrin on GST activity in M. macrocopa

圖4 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹 溞GPX活性的影響Fig. 4 Effects of Deltamethrin on GPX activity in M. macrocopa

3 討論

3.1 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹 溞的急性毒性

通過(guò)溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹 溞的急性毒性實(shí)驗(yàn), 測(cè)得其對(duì)裸腹 溞24、48h LC50分別為0.210和0.184 μg/L。當(dāng)多刺裸腹 溞暴露于較低濃度溴氰菊酯溶液中, 表現(xiàn)出四處游動(dòng), 試圖離開(kāi)燒杯, 而隨著暴露濃度和時(shí)間的增加,裸腹 溞游動(dòng)變得遲緩, 活動(dòng)明顯受到抑制。其原因可能是化合物對(duì)生物體的毒性大小受污染物在體內(nèi)積累量的影響, 也有可能是農(nóng)藥在生物體內(nèi)代謝成活性更高的毒物,從而導(dǎo)致正常的生物機(jī)體活動(dòng)受到影響。

3.2 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹 溞脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響

溴氰菊酯在機(jī)體代謝過(guò)程中可能產(chǎn)生活性氧、自由基等物質(zhì), 這些物質(zhì)攻擊生物膜系統(tǒng)中多聚不飽和脂肪酸而誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng), 并生成終產(chǎn)物MDA。因此, MDA含量可以間接反映機(jī)體的氧化損傷程度[16]。在本實(shí)驗(yàn)中, 當(dāng)溴氰菊酯濃度為 0.006 μg/L時(shí),MDA含量較對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05), 而0.013—0.100 μg/L各濃度組MDA含量均顯著升高(P<0.05), 且隨溴氰菊酯濃度增加呈逐漸升高的趨勢(shì)。機(jī)體清除自由基的抗氧化能力和氧化劑之間的平衡決定著MDA的生成量[7], 而其代謝溴氰菊酯的過(guò)程中產(chǎn)生了大量的自由基等氧化物質(zhì), 這些物質(zhì)打破了上述平衡, 導(dǎo)致自由基的大暴發(fā), 從而引起機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化, 并且其損傷程度隨毒物濃度的升高而增加。在0.100μg/L高濃度處理組, MDA含量達(dá)到最大值, 較對(duì)照組差異極顯著(P<0.01), 表明機(jī)體氧化損傷嚴(yán)重。濃度為 0.006μg/L的溴氰菊酯并未引起MDA含量的顯著升高(P>0.05), 表明此濃度機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化水平較低, 0.013 μg/L以上濃度機(jī)體即表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系, 證明多刺裸腹 溞對(duì)溴氰菊酯的敏感性較高。因此,MDA 含量可以靈敏反應(yīng)農(nóng)藥對(duì)多刺裸腹 溞的氧化損傷的程度。

3.3 溴氰菊酯對(duì)多刺裸腹溞解毒代謝指標(biāo)的影響

擬除蟲(chóng)菊酯類物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體, 細(xì)胞色素P450酶系首先發(fā)揮作用, 插入一個(gè)氧原子到疏水性分子, 使它們變得有活性或者具有親水性, 但是此過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生超氧化物, 超氧陰離子或者, 這些物質(zhì)可被GST和GPX代謝。因此, CYP450是參與機(jī)體解毒代謝第一階段的重要酶[18,19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 當(dāng)?shù)蜐舛蠕迩杈挣?.006、0.013 μg/L 處理多刺裸腹 溞后, CYP-ECOD活性被顯著誘導(dǎo)(P<0.05), 此為機(jī)體產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng), 一方面可能是溴氰菊酯代謝產(chǎn)生的活性氧、自由基不斷增加, 已合成的P450活性被誘導(dǎo); 另一方面, P450某些基因轉(zhuǎn)錄被激活, 導(dǎo)致其合成效率顯著升高[17]。在 0.050 μg/L處理24h和0.100 μg/L處理12h后, CYP-ECOD活性較對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05), 可能是由于 P450酶系包括許多家族和亞家族, 其功能有相同也有不同[20], 其中多種亞家族酶都具有 CYP-ECOD活性, 一種或幾種酶表達(dá)受到影響, 其他同工酶可繼續(xù)發(fā)揮類似的催化活性。CYP-ECOD活性具體由P450酶系中的哪些亞家族提供, 目前尚不清楚, 還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

在本實(shí)驗(yàn)中, GST在低濃度溴氰菊酯的誘導(dǎo)下活性升高, 而隨著濃度的升高, 其活性顯著降低(P<0.05)。本結(jié)果與溴氰菊酯脅迫后對(duì)羅非魚(yú)(Oreochromis aureus)GST的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)一致[21]。在12、24h, 0.006—0.050 μg/L各個(gè)濃度處理組, GST活力顯著升高(P<0.01), 表明低濃度溴氰菊酯會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生 GST, 主要用于催化谷胱甘肽與P450代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基、過(guò)氧化物等發(fā)生反應(yīng), 通過(guò)清除這些物質(zhì)以減少與細(xì)胞內(nèi)生物大分子結(jié)合的可能性, 保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[21]。0.100 μg/L高濃度處理裸腹 溞24h后, GST活力較對(duì)照組顯著降低(P<0.05),表明代謝產(chǎn)生的活性氧(ROS)等氧化物質(zhì)已不能被機(jī)體及時(shí)清除, 其累積毒性嚴(yán)重抑制了 GST的功能和合成,裸腹溞解毒代謝功能明顯下降。但Kostaropoulos, et al.[22]在研究農(nóng)藥對(duì)昆蟲(chóng)的毒性作用時(shí)發(fā)現(xiàn)：GST分子是作為一種結(jié)合蛋白與擬除蟲(chóng)菊酯結(jié)合, 以降低對(duì)參與解毒代謝的酶的毒性作用, 所以認(rèn)為 GST是通過(guò)一種隔離的機(jī)制增加機(jī)體的防御功能。然而, GST這兩種機(jī)制在多次裸腹 溞中還有待于證實(shí)。就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言, GST較適于作為水環(huán)境溴氰菊酯污染的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

GPX是生物機(jī)體內(nèi)解毒代謝第二階段另一種重要的抗氧化酶, 可催化H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O或使脂質(zhì)過(guò)氧化物還原為正常狀態(tài), 以防止細(xì)胞膜和其他生物組織受到破壞[23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在12、24h, 溴氰菊酯濃度為0.013、0.025 μg/L時(shí), GPX活性較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P<0.05), 說(shuō)明低濃度溴氰菊酯作后, GPX活性被激活, 溴氰菊酯代謝產(chǎn)生的 H2O2、脂質(zhì)過(guò)氧化物等被清除, 避免機(jī)體受到氧化損傷; 隨著濃度的增大, 溴氰菊酯的累積毒性增加, 機(jī)體產(chǎn)生的大量H2O2、自由基等不能被及時(shí)清除, GPX結(jié)構(gòu)可能遭到破壞, 而新生的 GPX又難以合成, 致使在0.100 μg/L濃度組, GPX活力迅速降至正常范圍以下(P<0.01)。在整個(gè)處理過(guò)程中GPX呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)高濃度抑制的毒理學(xué)效應(yīng)。

總之通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) GST和 GPX在溴氰菊酯脅迫后活性都有明顯的變化, 可以靈敏反應(yīng)其毒性作用。因此認(rèn)為, GST和GPX適于作為監(jiān)測(cè)水環(huán)境中溴氰菊酯污染的生化指標(biāo)。同時(shí), 本研究結(jié)果可為構(gòu)建生物監(jiān)測(cè)模型提供前期的理論基礎(chǔ)。