施 慧 謝建軍 王庚申 許文軍

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所, 浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 舟山 316100)

血卵渦鞭蟲是一類寄生性的原生動(dòng)物, 是近年來引起三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、“牛奶病”及鋸緣青蟹(Scylla serrata)“黃水病”的一種主要病原, 該蟲對(duì)宿主感染時(shí)間長(zhǎng), 流行范圍廣、發(fā)病率、死亡率較高, 危害嚴(yán)重, 給梭子蟹和青蟹的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來國(guó)內(nèi)已對(duì)該寄生蟲病原的生活史、形態(tài)學(xué)特征、感染途徑、診斷及防治技術(shù)等方面進(jìn)行了一些初步研究工作,積累了一定的基礎(chǔ)信息[1]。

20世紀(jì) 90年代以來, 隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,DNA分子技術(shù)日益成為區(qū)分物種的有效手段。目前應(yīng)用于寄生蟲分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究的DNA基因主要是核糖體18S rRNA和ITS基因。由于18S rDNA基因在生物進(jìn)化過程中具有高度保守性, 近年來國(guó)外學(xué)者根據(jù)18S rDNA基因序列設(shè)計(jì)引物, 運(yùn)用于寄生蟲分子生物學(xué)鑒定[2—4]。ITS區(qū)域受外界環(huán)境因素的影響較小, 所受選擇壓力小, 區(qū)域序列的進(jìn)化速度較其他區(qū)域快, 具有高變異性, 在物種間表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性, 可以從中獲得大量的遺傳信息, 目前 ITS序列作為非常有價(jià)值的遺傳標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于寄生蟲學(xué)的分類鑒定上。本研究開展了血卵渦鞭蟲18S rDNA基因和ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因序列的擴(kuò)增和測(cè)定, 經(jīng)與 GenBank中相關(guān)序列多態(tài)性比對(duì)分析, 構(gòu)建了血卵渦鞭蟲18S rDNA分子系統(tǒng)發(fā)育樹, 同時(shí)對(duì)不同宿主來源蟲體的18S rDNA 和ITS1進(jìn)行了同源性分析, 從DNA水平探討了該寄生原蟲的分類地位, 為我國(guó)血卵渦鞭蟲病的分子流行病學(xué)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血卵渦鞭蟲樣本

初步診斷為血卵渦鞭蟲感染的病蟹來源于浙江舟山佛渡鄉(xiāng)養(yǎng)殖的三疣梭子蟹和浙江三門養(yǎng)殖的鋸緣青蟹,取血淋巴, 用 95%乙醇固定, 本實(shí)驗(yàn)室保存, 編號(hào)為:ZHSH2006-1和ZHSH2006-2。

1.2 主要試劑

總基因組DNA提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品, Taq酶、dNTPs、DNA純化試劑盒均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.3 血卵渦鞭蟲的PCR擴(kuò)增鑒定

將固定的病蟹血淋巴樣品, 按Qiagen DNA zsol kit說明書提取總基因組 DNA, 用已建立的針對(duì)血卵渦鞭蟲的PCR快速診斷方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定[8]。

1.4 病原18S rDNA和ITS1-5.8S-ITS2序列擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)[5—7]設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物, 引物由生工(上海)生物工程有限公司合成, 引物序列(表1)。

表1 血卵渦鞭蟲PCR擴(kuò)增用引物Tab.1 Nucleotide sequence of primers for Hematodinium sp.

18S rDNA的擴(kuò)增選擇真核生物18S rDNA通用擴(kuò)增引物EukA和EukB, PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min;94℃ 45s, 55℃ 1min, 72℃ 3min, 共 30個(gè)循環(huán), 最后 72℃延伸10min。ITS1-5.8S-ITS2區(qū)域擴(kuò)增選擇真核生物ITS通用擴(kuò)增引物 ITS1和 ITS4, PCR反應(yīng)條件為 95℃變性5min; 然后 94℃ 45s, 52℃ 45s, 72℃ 45s, 30個(gè)循環(huán)后, 于72℃延伸10min。PCR 反應(yīng)體系均為25 μL, 其中超純水19.25 μL, 10× Reaction buffer 2.5 μL, 引物(50 pmol/L) 0.5 μL,dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL, 模板 2.5 μL, Taq 酶 0.25 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)UNIQ-10 柱式膠回收試劑盒純化后, 寄生工(上海)生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 18S rDNA和ITS1序列分析

利用NCBI在線BLAST程序, 對(duì)本次獲取的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。將獲取的18S rDNA和ITS1基因序列用DNAMAN軟件進(jìn)行排序、比對(duì)并輔以人工校正, 同時(shí)應(yīng)用NCBI中在線軟件BLAST對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行同源檢索。從 GenBank中取得相關(guān)血卵渦鞭蟲類的序列作參考(表2), 使用MEGA 3.1分析軟件, Kimura-2法計(jì)算遺傳距離, 并采用bootstrap(重復(fù)次數(shù)1000)檢查聚類樹各分支置信度, 鄰接法(Neighbor Joining, NJ)構(gòu)建分子發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 病蟹血淋巴液顯微鏡檢

病蟹血淋巴中的無顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞3種血淋巴細(xì)胞的量較正常蟹的急劇下降, 代之以大量寄生原蟲。從不同病蟹的血淋巴液中可觀察到不同發(fā)育階段的蟲體, 多數(shù)呈卵圓型, 單核或多核, 大小約 5—10 μm不等, 仔細(xì)觀察, 有些可見2根長(zhǎng)度不等的鞭毛(圖1)。

2.2 血卵渦鞭蟲的PCR鑒定結(jié)果

以提取的總基因組為模板, 用血卵渦鞭蟲的特異性引物從實(shí)驗(yàn)樣本中成功擴(kuò)增出 580 bp左右的特異條帶,其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)。

2.3 血卵渦鞭蟲的rDNA基因序列比較分析

兩株蟲體的 rDNA基因序列與血卵渦鞭蟲屬的序列同源性最高, 經(jīng)比對(duì)ZHSH2006-1和ZHSH2006-2的18S rDNA基因序列同源性為99.55%, 兩者與 GenBank中登錄的 FJ834441的同源性為 99.5%。上述結(jié)果表明, 所獲的序列確屬擬測(cè)定的目標(biāo)片段。從 GenBank中下載來源于海水和海水甲殼類的腰鞭毛蟲相關(guān)序列, 用 MEGA3.1軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 3)。從進(jìn)化樹可見, 所有收集的血卵渦鞭蟲都起源于共同的祖先, 所有序列分為兩個(gè)集群, 血卵渦鞭蟲與其他Syndinida目的蟲體處于同一集群中, 又與 8株來自不同十足目的血卵渦鞭蟲聚為 Hema-todinium sp.分支, 同時(shí)顯示與分離自 Liocarcinus depurator和藍(lán)蟹(Callinectes sapidus)的血卵渦鞭蟲親緣關(guān)系更加密切。

表2 血卵渦鞭蟲核糖體18S rDNA和ITS1基因序列來源Tab. 2 Origins of 18S rDNA and ITS1 gene sequences of Hematodinium ribosome

圖1 發(fā)病蟹血淋巴中的血卵渦鞭蟲 (1000×)Fig. 1 Hematodinium sp. from hemolymph of diseased crab

本次獲得的 ZHSH 2006-1株和 ZHSH2006-2株 ITS1-5.8S-ITS2基因片段同源性為 100%, 大小為888 bp, 包括全部ITS1(344 bp)、5.8S rDNA(150 bp)和ITS2(394 bp)(GenBank登錄號(hào): JQ692310、JQ928405)。將獲得的 18S rDNA和ITS1部分基因分別與GenBank中已有血卵渦鞭蟲的相應(yīng)序列用 DNAStar軟件進(jìn)行比較分析。從18S rDNA同源性分析來看, 不同宿主來源蟲體之間差異很小, 蟲株ZHSH2006-1和ZHSH2006-2的18S rDNA序列與其他血卵渦鞭蟲的18S rDNA序列同源性達(dá)99.2%以上(表3); 但不同宿主來源蟲體ITS1進(jìn)化速度較快, 獲得的ITS1序列與其他登錄的序列比對(duì)有明顯差異, 同源性高低不等(表 4)。而獲得的 5.8S rDNA-ITS2 基因序列在 GenBank中未找到相關(guān)的序列(圖4)。

圖2 血卵渦鞭蟲 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果Fig. 2 Sensitivity of PCR assay for detection of Hematodinium sp.

3 討論

血卵渦鞭蟲(Hematodinium)隸屬于植鞭動(dòng)物門(phylum Sarcomastigophora)、腰鞭蟲綱(order DinoflagelIida)、Syndiniceae科、Syndinida目、血卵渦鞭蟲屬。自1931年Chatton, et al.[9]首次報(bào)道法國(guó)沿岸綠蟹的血卵渦鞭蟲(Hematodinium perezi)感染以來, 至今國(guó)外許多地區(qū)包括澳大利亞、阿拉斯加、蘇格蘭、加拿大以及美國(guó)東部沿岸等地均發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了該寄生蟲病的流行, 該病的流行已威脅到挪威龍蝦(Nephrops norvegicus)、藍(lán)蟹、白氏雪蟹(Chionoecetes bairdi)以及蛛雪蟹(Chionoecetes opilio)等許多重要經(jīng)濟(jì)甲殼類的漁業(yè)生產(chǎn)[10—18]。目前國(guó)外有不少來自十足目種類血卵渦鞭蟲基因片段的 18S rDNA 核酸序列已經(jīng)確定[19—21], 但目前這部分工作尚不完善。國(guó)內(nèi)自2006年首次報(bào)道養(yǎng)殖梭子蟹血卵渦鞭蟲感染以來, 已相繼在鋸緣青蟹、日本 蟳和脊尾白蝦中發(fā)現(xiàn)該寄生蟲感染, 但目前為止還沒有血卵渦鞭蟲18S rDNA核酸全序列的報(bào)道, ITS區(qū)域也只對(duì)部分的ITS1序列進(jìn)行了比對(duì)分析[22]。

ITS是核糖體DNA(rDNA)中介于18S和28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū), 包括 ITS1和 ITS2兩段序列, 分別位于18S—5.8S和5.8S—28S之間。盡管ITS序列的非編碼區(qū)(ITS1和 ITS2)生物學(xué)功能目前還不是很清楚, 但越來越多的證據(jù)表明, 這 2個(gè)高度可變的區(qū)域在核糖體進(jìn)化中起著重要作用[23]。雖然ITS區(qū)堿基數(shù)少, rRNA轉(zhuǎn)錄復(fù)雜,但他們沒有翻譯成有功能的蛋白質(zhì)序列, 并因此進(jìn)化速度較快, 具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特性。許多研究表明, ITS序列是研究寄生蟲分類鑒定及遺傳變異的理想標(biāo)記[24]。目前認(rèn)為18S rDNA序列這類高度保守區(qū)域可以用來進(jìn)行高級(jí)類群間系統(tǒng)進(jìn)化的比較分析, 而 ITS更適合于解決較低分類群如種間或種內(nèi)不同株差異的問題。周榮瓊等[25]利用ITS1序列測(cè)定及分析發(fā)現(xiàn)ITS1片段可作為隱孢子蟲屬的種間鑒定種的遺傳標(biāo)記。

本研究對(duì)血卵渦鞭蟲的18S rDNA和ITS序列的比對(duì)分析顯示, 屬內(nèi)18S rDNA進(jìn)化保守, 序列高度同源, 不同宿主來源血卵渦鞭蟲的同源性高達(dá)99.2%。獲得的兩株血卵渦鞭蟲宿主分別是三疣梭子蟹和鋸緣青蟹, 其 18S rDNA基因序列之間同源性高達(dá) 99.6%, 說明 18S rDNA序列可以用于血卵渦鞭蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析。將 GenBank中相關(guān) ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析時(shí)發(fā)現(xiàn), 所獲的兩個(gè)ITS1序列與 GenBank中相關(guān) ITS1序列的同源性最高在 97.7%,最低為21.2%, 這說明感染我國(guó)梭子蟹和青蟹的血卵渦鞭蟲與國(guó)外分離獲得的血卵渦鞭蟲屬于不同基因型。同時(shí)分析結(jié)果也顯示, 來源于不同宿主的血卵渦鞭蟲的 ITS1高度特異。但獲得的兩株蟲體的ITS1序列之間同源性很高,達(dá) 100%, 這可能與宿主所處的地理位置有一定關(guān)系。Small, et al.[26]對(duì)分離自不同十足目的血卵渦鞭蟲ITS1序列測(cè)定及分析發(fā)現(xiàn)不同海域來源的血卵渦鞭蟲ITS1區(qū)核酸存在一定差異。另外ITS1分析結(jié)果也顯示分離自三疣梭子蟹和青蟹的血卵渦鞭蟲與國(guó)外分離自藍(lán)蟹和Liocarcinus depurator的血卵渦鞭蟲的ITS1序列同源性要明顯高于其他株系, 達(dá) 94%以上, 這可能與寄生的宿主有關(guān), 藍(lán)蟹和Liocarcinus depurator與我國(guó)三疣梭子蟹及鋸緣青蟹雖然所產(chǎn)地理位置不同但都屬于梭子蟹科。本文根據(jù)以上結(jié)果初步確定血卵渦鞭蟲ITS1區(qū)核酸更適用于血卵渦鞭蟲屬內(nèi)的分類學(xué)研究。目前國(guó)際上關(guān)于血卵渦鞭蟲ITS序列信息不及18S rDNA序列豐富, 本研究未根據(jù)獲得的 ITS區(qū)域構(gòu)建血卵渦鞭蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹。GenBank中相關(guān)ITS2基因序列信息不全, 本文也未能對(duì)ITS2序列進(jìn)行比對(duì)分析, ITS1與ITS2在血卵渦鞭蟲蟲株進(jìn)化過程中所起的作用是否一致, 還有待進(jìn)一步探討。

圖3 采用N-J法根據(jù)腰鞭毛蟲類18S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 The phylogenetic tree of dinoflagellata -like organism based on 18S rDNA gene using the Neighbor-Joining method

表3 血卵渦鞭蟲種內(nèi)蟲株的18S rDNA序列同源性比較分析Tab. 3 Analysis of 18S rDNA sequence similarity between Hematodiniums

表4 血卵渦鞭蟲種內(nèi)蟲株的ITS1全長(zhǎng)序列之間同源性比較分析Tab. 4 Analysis of full-length ITS1 sequence similarity between Hematodiniums

圖4 ZHSH2006-1株和ZHSH2006-2株5.8S rDNA -ITS2序列Fig. 4 5.8S rDNA-ITS2 gene sequence of ZHSH2006-1and ZHSH2006-2 5.8S rDNA: 150 bp; ITS2: 394 bp