胡白瑛

（柳州市柳鐵中心醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西柳州545007）

肌酐代謝產(chǎn)物對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

胡白瑛

（柳州市柳鐵中心醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西柳州545007）

目的研究肌酐產(chǎn)物是否能促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡。方法原代培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞，將肌酐產(chǎn)物與腎小管上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)，對(duì)腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；抽提DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳觀察有無(wú)梯形條帶。結(jié)果腎小管上皮細(xì)胞在肌酐產(chǎn)物作用下逐漸變小、變圓、固縮，最后漂浮死亡，但胞膜始終完整；肌酐產(chǎn)物導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡，瓊脂糖凝膠中有DNA梯形條帶，加入谷胱甘肽(GSH)未見(jiàn)DNA梯形條帶。結(jié)論肌酐產(chǎn)物促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，GSH可阻斷之。

肌酐產(chǎn)物；腎小管上皮細(xì)胞；凋亡

慢性腎功能不全進(jìn)行性惡化的主要病理基礎(chǔ)一直被認(rèn)為是腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)腎臟細(xì)胞調(diào)亡也是加劇腎功能不全的主要因素，但誘發(fā)細(xì)胞調(diào)亡及其環(huán)節(jié)尚不清楚。本文以肌酐代謝產(chǎn)物對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的作用，觀察是否有誘發(fā)調(diào)亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料(1)原代培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞；(2)分解肌酐能力最強(qiáng)的尿毒癥患者腸道之肺炎克雷伯氏菌；(3)肌酐。

1.2 方法(1)取含0.14 mg/ml肌酐的無(wú)蛋白培養(yǎng)液1 ml于Eppendoff管中，每管中加入1菌環(huán)肺炎克雷伯氏菌，放入37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，然后離心取上清液，矯正pH后過(guò)濾除菌，作為肌酐產(chǎn)物備用。在腎小管上皮細(xì)胞傳代第5 d后，用上清液與完全培養(yǎng)液以1/9的比例混合的混合液代替完全培養(yǎng)液，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。加入谷胱甘肽做為對(duì)照組。(2)收集培養(yǎng)了2 d、3 d、4 d、5 d、6 d的腎小管上皮細(xì)胞及對(duì)照組的腎小管上皮細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)106個(gè)，將細(xì)胞溶解在裂解液中，37℃保溫18 h以上，再用飽和苯酚、氯仿、異戊醇抽提上清液2次，經(jīng)乙醇-20℃沉淀后，離心30 min，再用適量的TE溶解，加RNase酶5 mg/L，37℃溫育1 h，降解RNA后，在加入溴化乙錠的1.6%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察梯形條帶并成像。

2 結(jié)果

2.1 肌酐產(chǎn)物作用下的腎小管上皮細(xì)胞肌酐產(chǎn)物組的腎小管上皮細(xì)胞12 h出現(xiàn)形態(tài)改變，細(xì)胞有較多空泡產(chǎn)生，由扁平伸展逐漸變小變圓，細(xì)胞逐漸固縮，但胞膜完整，最后第7天全部脫落懸浮。對(duì)照組僅產(chǎn)生少量氣泡，無(wú)其他表現(xiàn)，見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 加入肌酐產(chǎn)物48 h的腎小管上皮細(xì)胞（光鏡×400）

圖2 加入肌酐96 h的腎小管上皮細(xì)胞（光鏡×400）

圖3 加入肌酐7 d的腎小管上皮細(xì)胞(光鏡×400)

2.2 凋亡的腎小管上皮細(xì)胞的梯形條帶第一泳道為加入肌酐產(chǎn)物第4天的腎小管上皮細(xì)胞中抽提的DNA。第二泳道為100 bp DNA Ladder marker，自下而上依次為100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1 000 bp、1 500 bp。第三泳道為加入GSH的對(duì)照組。見(jiàn)圖4

圖4 瓊脂糖電泳DNA梯形條帶

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肌酐代謝產(chǎn)物對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的影響出現(xiàn)了以下特點(diǎn)：加入肌酐產(chǎn)物1 d起細(xì)胞就開(kāi)始有變化，1～2 d內(nèi)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，第4天細(xì)胞明顯變小、變圓，繼而出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，但胞膜完整，最后細(xì)胞漂浮死亡。符合凋亡的特征。

對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究表明，半胱氨酰天冬酸特異性蛋白-3(Caspase-3)激活的絲氨酸蛋白-凋亡蛋白酶(AP24)誘導(dǎo)凋亡時(shí)細(xì)胞核DNA鏈的碎裂。DNA鏈碎裂系激活細(xì)胞核內(nèi)的核酸限制性?xún)?nèi)切酶，使染色體有控降解，DNA在核小體間被切成180～200 bp及其倍數(shù)的核苷酸片段，在瓊脂糖電泳上呈現(xiàn)特征性的梯形條帶。在本實(shí)驗(yàn)中我們?cè)诓煌瑫r(shí)段收集細(xì)胞進(jìn)行DNA抽提，并進(jìn)行瓊脂糖電泳，出現(xiàn)了DNA梯形條帶，其中以第4天最為明顯。說(shuō)明細(xì)菌作用于肌酐的代謝產(chǎn)物確實(shí)可引起腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。實(shí)驗(yàn)中加入GSH的第3泳道未出現(xiàn)DNA梯形條帶，說(shuō)明GSH可以預(yù)防細(xì)菌作用于肌酐的代謝產(chǎn)物引起的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。

GSH抗細(xì)胞凋亡可能與下列環(huán)節(jié)有關(guān)：(1)GSH含量降低是一種潛在的凋亡早期激活信號(hào)。研究認(rèn)為氧化應(yīng)激狀態(tài)下，隨著活性氧產(chǎn)生的增加，細(xì)胞內(nèi)GSH含量降低[1]，在外部凋亡刺激的情況下誘發(fā)了多種凋亡信號(hào)的產(chǎn)生；3 h后可見(jiàn)NFκB(轉(zhuǎn)錄因子κ基因結(jié)合核因子)的RelA亞基的激活和核易位；24 h后一種縮短形式的p53蛋白呈時(shí)間依賴(lài)的表達(dá)；48～72 h后隨著線(xiàn)粒體GSH耗竭和ROS(反應(yīng)性氧類(lèi))產(chǎn)生增加,細(xì)胞產(chǎn)生了凋亡。(2)GSH耗竭，DNA易碎裂。在HL-60細(xì)胞及PW白細(xì)胞，Bcl-2(B細(xì)胞淋巴細(xì)胞/白細(xì)胞-2)基因的過(guò)度表達(dá)抑制腫瘤壞死因子及紫外線(xiàn)誘發(fā)的AP24蛋白酶激活，抑制細(xì)胞凋亡；但GSH耗竭及Bcl-2過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子及紫外線(xiàn)激活的AP24蛋白酶敏感并且產(chǎn)生凋亡；GSH耗竭時(shí)Bcl-2過(guò)度表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞核對(duì)AP24誘導(dǎo)的DNA碎裂敏感性高。

本實(shí)驗(yàn)中肌酐代謝產(chǎn)物作用于腎小管上皮細(xì)胞就是使其處于氧化應(yīng)激中，消耗其GSH，使GSH含量降低，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡，故加入GSH可防止凋亡。亦有文獻(xiàn)證實(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化、活性氧、自由基均可引起腎小管上皮細(xì)胞的壞死和凋亡[2-3]。

本實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞凋亡在慢性腎功能衰竭中扮演重要角色。肌酐產(chǎn)物通過(guò)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡促進(jìn)腎小管萎縮，加劇了腎功能衰竭，這是慢性腎衰腎功能惡化機(jī)制之一。氧化損傷、GSH減少是引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡的兩個(gè)重要因素。這有助于我們尋找新的特異性的治療手段干預(yù)慢性腎功能衰竭，如抗氧化劑GSH的應(yīng)用。對(duì)Bcl 2家族和Caspase等凋亡途徑干預(yù)來(lái)治療慢性腎功能衰竭，可望在慢性腎衰進(jìn)行性惡化的控制上提供新的啟示。

[1]Armstrong JS,Steinauer KK,Hornung B,et al.Role of glutathionede depletion and reactive oxygen species generation in apoptotic signalingina human B lymphoma cell line[J].Cell Death Differ, 2002,9(3):252-263

[2]Baek SM,Kwon CH,Kim JH,et al.Differential roles of hydrogen peroxide and hydroxyl radical in cisplatin-induced cell death in renal proximal tubular epithelial crlls[J].J Lab Clin Med,2003,142 (3):178-186

[3]周萍，趙廣成，吳玉斌,等.氧化應(yīng)激對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及L-EGCG的保護(hù)作用[J].醫(yī)學(xué)臨床研究,2010, 27(10):1804-1808.

Effect of metabolites of creatinine on the apoptosis of renal tubular epithelial cells.

HU Bai-ying.Department of Nephrology,Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital,Liuzhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo study the effect of metabolites of creatinine on the apoptosis of renal tubular epithelial cells.MethodsRenal tubular epithelia were cultured in vitro.The metabolites of creatinine and renal tubular epithelial cells were incubated together.The morphological change of renal tubular epithelial cells was observed.Gel electrophoresis of DNA extracted from that to observe bands of apoptotsis.ResultsAffected by metabolites of creatinine,renal tubular epithelial cells showed characters of apoptosis(smaller,round,pyknosis and death),but the cell membrane was always integral.Agarose gel electrophoresis revealed the appearance of DNA ladder,which disappeared with the addition of GSH.ConclusionThe metabolites of creatinine can induce the apoptosis of renal tubular epithelial cells,which could be reversed by GSH.

Metabolite of creatinine;Renal tubular epithelial cells;Apoptosis

R334+.1

A

1003—6350（2013）09—1268—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0536

2012-11-28)

胡白瑛。E-mail：hubaiying@sohu.com