楊新婷 梁清濤 楊揚(yáng) 李琦 陳效友

·論 著 ·

不同抗原全血ELISA檢測技術(shù)對活動性肺結(jié)核的輔助診斷價值研究

楊新婷 梁清濤 楊揚(yáng) 李琦 陳效友

目的 探討克隆表達(dá)的抗原PPD、早期分泌抗原靶6（ESAT-6）/培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP-10）融合蛋白（簡寫為E/C）和ESAT-6的全血干擾素釋放試驗(yàn)對活動性肺結(jié)核的輔助診斷價值。方法 選取活動性結(jié)核組96例和對照組91例共計187例,抽取清晨空腹肝素鈉抗凝外周靜脈血5 ml,分別給以抗原PPD、E/C和EAST-6刺激,通過ELISA的方法檢測抗原刺激后血漿中IFN-γ的數(shù)值。結(jié)果 在活動性肺結(jié)核組中3種抗原刺激后IFN-γ含量的中位數(shù)分別為ESAT-6［96（41～379）pg/ml］、E/C［3180（1192～7231）pg/ml］、PPD［4348（1230～9026）pg/ml］；明顯高于對照組中IFN-γ含量ESAT-6［10（4～52）］、E/C［210（49～523）］、PPD［1800（70～3021）pg/ml］,U值分別為1190.5、2405和1309.5,P值均＜0.01；ESAT-6、E/C和PPD的全血ELISA敏感度分別為78.1%（75/96）、87.5%（84/96）和85.4%（82/96）,特異度分別為76.9%（70/91）、83.5%（76/91）和65.9%（60/91）。結(jié)論 融合蛋白ESAT-6/CFP-10對活動性結(jié)核病具有一定的輔助診斷價值。

結(jié)核,肺/診斷； 重組融合蛋白質(zhì)類； 酶聯(lián)免疫吸附測定； γ干擾素釋放試驗(yàn)

活動性結(jié)核病中肺結(jié)核約占85%,而菌陰肺結(jié)核約占肺結(jié)核的50%～70%［1］。痰Mtb培養(yǎng)一直是診斷活動性肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn),但其陽性率較低,且費(fèi)時。菌陰肺結(jié)核大多僅能得到臨床診斷,確診相對困難。因此,開發(fā)新的非細(xì)菌學(xué)診斷技術(shù)將為結(jié)核病的早期診斷提供幫助。

早期分泌抗原靶6（early secretory antigenic target 6,ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白10（culture filtrate protein 10,CFP-10）是Mtb復(fù)合群基因組中RD1區(qū)域編碼的結(jié)核特異性抗原及T細(xì)胞最主要的靶抗原,可誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)［2-3］。應(yīng)用結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10進(jìn)行的全血ELISA是通過檢測經(jīng)過抗原刺激后細(xì)胞因子的濃度評價患者細(xì)胞免疫功能的方法,在Mtb感染和結(jié)核病的診斷方面具有敏感、快速、穩(wěn)定等特點(diǎn)［4-5］,但在結(jié)核病高流行國家的相關(guān)研究報道較少,同時這種檢測技術(shù)價格昂貴,不適于在我國這種低收入國家廣泛開展。為此,筆者采用克隆表達(dá)的PPD、ESAT-6/CFP-10融合蛋白（簡寫為E/C）和ESAT-6作為抗原進(jìn)行全血ELISA檢測血漿中經(jīng)抗原刺激的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌γ干擾素的濃度,以探討此項(xiàng)檢測技術(shù)在我國對結(jié)核病的輔助診斷意義。

對象和方法

一、對象

1.肺結(jié)核組：2010年6月至2011年1月期間我院住院初治結(jié)核病患者共計96例,其中男54例, 女42例,年齡16～90歲,平均年齡（42.8±10.1）歲。具體包括：（1）菌陽肺結(jié)核49例,其中男27例, 女22例,年齡17～90歲,平均年齡（46.8±10.4）歲；（2）菌陰肺結(jié)核47例,其中男27例,女20例,年齡16～76歲,平均年齡（38.3±7.8）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）菌陽肺結(jié)核：痰抗酸桿菌涂片連續(xù)2次（+）,或1次（++）,或1次培養(yǎng)陽性；（2）菌陰肺結(jié)核：痰抗酸桿菌3次涂片陰性及1次培養(yǎng)陰性,具有典型的肺結(jié)核臨床癥狀和胸部X線表現(xiàn),抗結(jié)核治療有效,臨床可排除其他非結(jié)核性肺部疾患［6］；有上述情況之一者入選本試驗(yàn)。結(jié)核組根據(jù)是否合并糖尿病分為單純肺結(jié)核患者組76例,糖尿病合并肺結(jié)核患者組20例；所選患者均經(jīng)HIV檢測陰性、無妊娠和應(yīng)用免疫抑制劑等病史。

2.對照組：共計91例,包括健康對照組和疾病對照組。（1）健康對照組：既往身體健康,否認(rèn)結(jié)核病接觸史,無臨床癥狀,X線胸片無異常,ELISPOT陰性的本院新畢業(yè)職工、健康體檢的學(xué)生和外來務(wù)工人員。共計35例,男13例,女22例,年齡18～37歲,平均年齡（30.8±6.1）歲。（2）疾病對照組：為同期住院非結(jié)核病患者,所選患者均經(jīng) HIV檢測陰性、無妊娠、無應(yīng)用免疫抑制劑和免疫增強(qiáng)劑病史。共計56例,其中男33例,女23例,年齡19～82歲,平均年齡（54.3±12.1）歲。包括肺癌43例和肺部其他疾病13例。

二、方法

1.標(biāo)本采集和培養(yǎng)：所有入組的結(jié)核病患者及對照組均抽取清晨空腹肝素抗凝的外周靜脈血5 ml,6 h內(nèi)加入24孔培養(yǎng)板（1 ml/孔）,每孔依次加入PHA、PPD、ESAT-6、E/C、生理鹽水及外周靜脈血標(biāo)本,其中PPD、ESAT-6、E/C融合抗原由中國生物制品檢定所王國治教授惠贈,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,各抗原的終濃度分別為PHA（20μg/ml）、PPD（20μg/ml）、ESAT-6（40μg/ml）、E/C（20μg/ml）, 于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育過夜約16～22 h,每孔收集血漿至少300μl。

2.ELISA法檢測血漿IFN-γ的濃度：采用美國BD公司生產(chǎn)的IFN-γ檢測試劑盒,按照試劑盒要求進(jìn)行操作,各樣本的IFN-γ濃度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線上的樣本吸光度值來確定。兩副孔濃度差小于15%,中位數(shù)數(shù)值作為IFN-γ濃度值,＞15%者需重新測定。

3.結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：各抗原的診斷界值根據(jù)ROC曲線設(shè)定,ESAT-6的界定值為31 pg/ml,E/C界定值為1458 pg/ml,PPD界定值為2068 pg/ml,陽性定義為大于等于界定值且3倍于陰性對照孔且陰性對照孔＜100 pg/ml；陰性定義為小于界定值且陽性對照＞150 pg/ml且陰性對照孔＜100 pg/ml；無法確定值：陽性對照孔＜150 pg/ml且抗原孔為陰性時或陰性對照孔＞100 pg/ml。由于機(jī)體對陽性刺激不反應(yīng),或由于污染使得陰性對照孔出現(xiàn)陽性反應(yīng),致無法判定結(jié)果為陽性還是陰性,需要重新檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用±s表示,非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位間距）表示；各組樣本率的比較和相關(guān)性應(yīng)用Pearsonχ2檢驗(yàn)；各組樣本間抗原刺激后分泌的IFN-γ濃度的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn),兩組間的比較應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.抗原濃度的確定：分別選取不同濃度（5、10、20、40μg/ml）的3種抗原（ESAT-6、E/C、PPD）進(jìn)行刺激并測定分泌的IFN-γ,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,各抗原的終濃度分別確定為PHA（20μg/ml）、PPD （20μg/ml）、ESAT-6（40μg/ml）、E/C（20μg/ml）。

2.抗原ESAT-6、E/C、PPD刺激后全血ELISA 的IFN-γ的含量結(jié)果：結(jié)核組中IFN-γ含量的中位數(shù)（四分位間距）分別為96（41～379）、3180（1192～7231）、4348（1230～9026）pg/ml,明顯高于對照組中IFN-γ含量10（4～52）、210（49～523）、1800 （70～3021）pg/ml,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,U值分別為1190.5、2405和1309.5,P值均＜0.01。

3.3 種抗原的全血ELISA檢測的診斷效果評價：結(jié)核組E/C和PPD的全血ELISA敏感度與ESAT-6全血ELISA的敏感度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,ESAT-6全血ELISA的特異度與PPD全血ELISA比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而E/C全血ELISA的特異度明顯高于PPD全血ELISA（表1）。結(jié)核組中3種抗原刺激后IFN-γ含量與敏感度相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。結(jié)核組中不確定結(jié)果共3例,對照組中不確定結(jié)果1例。

4.單純肺結(jié)核組和合并糖尿病組3種抗原刺激后全血ELISA的IFN-γ的含量比較：無糖尿病結(jié)核組IFN-γ含量的中位數(shù)（四分位間距）分別為86 （32～675）、2686（1156～8792）、4188（1219～926）pg/ml；有糖尿病結(jié)核組中IFN-γ含量分別為63.5 （0～525）、2492.5（949～5561）、3953（868～6410）pg/ml,兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,U值分別為1194.5、1991和1565,P值均＞0.05。其中單純肺結(jié)核組中2例不確定結(jié)果,合并糖尿病組1例不確定結(jié)果。

討 論

人體初次感染Mtb后初始T淋巴細(xì)胞會轉(zhuǎn)化為記憶T淋巴細(xì)胞,當(dāng)再次接觸Mtb后,則迅速產(chǎn)生效應(yīng)T淋巴細(xì)胞,并產(chǎn)生多種細(xì)胞因子發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng),IFN-γ是其中最關(guān)鍵的細(xì)胞因子。本研究中結(jié)核組3種抗原刺激后血漿中IFN-γ的含量明顯高于對照組,表明這3種抗原可以使機(jī)體產(chǎn)生高水平的IFN-γ,據(jù)此可以判斷機(jī)體是否感染Mtb［7］。

E/C和PPD的全血ELISA具有相對較高的敏感度,ESAT-6的敏感度略低,但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Mtb基因RD1區(qū)域僅存在于致病性分枝桿菌中,所有卡介苗和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌基因組中均不含有此基因,其編碼的蛋白ESAT-6和CFP-10是結(jié)核特異性蛋白。ESAT-6是T淋巴細(xì)胞最主要的靶抗原之一,含有多個特異性T細(xì)胞表位,但不足以囊括所有表位,由于重組蛋白中蛋白表位聚集的程度相對較低。因此,單獨(dú)應(yīng)用ESAT-6的敏感度略低,而ESAT-6/CFP-10融合蛋白含有ESAT-6 和CFP-10兩種成分,含有更多的抗原表位,因此能夠激發(fā)更廣泛和更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)［8］。PPD全血ELISA的敏感度與E/C相似,推測由于其含有Mtb、卡介苗等200多種成分,抗原性和免疫原性較強(qiáng),因此導(dǎo)致其敏感度相對較高［9］。

菌陽肺結(jié)核和菌陰肺結(jié)核兩組間全血ELISA血漿中γ干擾素含量和敏感度差異無統(tǒng)計學(xué)意義,即無論荷菌量的多少,3種抗原刺激后均可在全血進(jìn)行ELISA檢測到IFN-γ較高的濃度,因此可以認(rèn)為即通過檢測機(jī)體的細(xì)胞免疫水平來作出活動性結(jié)核病的診斷。從而提示全血ELISA檢測有可能為診斷提供一定的依據(jù)［10］。

全血ELISA干擾素釋放試驗(yàn)最早用于歐美等結(jié)核病低流行國家Mtb感染的診斷,其特異度可以高達(dá)92%～100%［11］。本研究中3種抗原全血ELISA的特異度相對略低,考慮原因可能為,我國為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家,即使沒有明確的結(jié)核病暴露史也有可能存在潛伏感染,從而使得特異度下降,限制了其使用［12］。但是本研究顯示,結(jié)核特異抗原的全血干擾素釋放試驗(yàn)特異度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PPD抗原,這是因?yàn)镻PD受到卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染的影響。因此,與傳統(tǒng)的體內(nèi)結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)相比較,該試驗(yàn)有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。

表1 3種抗原全血ELISA檢測的診斷評價

表2 菌陽與菌陰肺結(jié)核組全血ELISA血漿中IFN-γ的含量和敏感度比較

糖尿病是結(jié)核病的重要危險因素,糖尿病也會對結(jié)核病的診斷和治療產(chǎn)生影響,臨床工作中,糖尿病合并肺結(jié)核的診斷存在困難,因?yàn)樘悄虿』颊呒?xì)胞免疫功能低下,傳統(tǒng)TST試驗(yàn)和結(jié)核抗體檢測往往呈假陰性。在本研究中無論是否患有糖尿病, 3種抗原的全血ELISA陽性率無明顯差別,這就提示這種檢測技術(shù)具有較高的敏感度,不受糖尿病患者免疫狀態(tài)的影響,在其他的研究中也可以得到相似的結(jié)論,提示該試驗(yàn)對臨床糖尿病合并肺結(jié)核患者的診斷有較高的價值［13］。遺憾的是本研究中肺結(jié)核合并糖尿病的患者較少,還需要進(jìn)一步研究,以期獲得更加客觀準(zhǔn)確的結(jié)果。E/C全血ELISA有可能作為活動性結(jié)核病的輔助診斷手段,但其特異度可能受 Mtb潛伏感染的影響而有所下降。為了準(zhǔn)確判斷其對結(jié)核病的輔助診斷價值,在以后的研究中還需要擴(kuò)大樣本量,并進(jìn)行前瞻性研究。

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Study on the value of diagnosis for active pulmonary tuberculosis with the blood ELISA stimulated by three antigens

YANG Xin-ting,LIANG Qing-tao,YANG Yang,LI Qi,CHEN Xiao-you. The 3rd Department of Tuberculosis,Beijing Chest Hospital,Capital Medical University,Beijing Tuberculosis&Thoracic Tumor Research Institute,Beijing 101149,China C
orresponding author：CHEN Xiao-you,Email：chenxy1998@hotmail.com

Objective To evaluate the value of diagnosis for active pulmonary tuberculosis with blood interferon gamma release assay stimulated by three antigens of PPD,ESAT-6/CFP-10 fusion protein（E/C）and ESAT-6. Methods 187 participants including patients with active pulmonary tuberculosis and control were enrolled.5 ml morning fasting venous heparinazed blood were taken from all participants and stimulated by purified protein derivative（PPD）,early secretory antigenic target 6（ESAT-6）and E/C.The production of IFN-γwas measured by ELISA after incubated for 16-22 hours.Results The production of IFN-γstimulated by ESAT-6,E/Cand PPDin active pulmonary tuberculosis was 96（41-379）,3180（1192-7231）and 4348（1230-9026）pg/ml,respectively.It was much higher than that in control（ESAT-6：10（4-52）、E/C：210（49-523）、PPD：1800（70-3021）,U=1190.5、2405和1309.5,P＜0.01）.The sensitivity and specificity of ESAT-6,E/C and PPD were 78.1%（75/96）vs 76.9%（70/91）、87.5%（84/96）vs 83.5%（76/91）and 85.4%（82/96）vs 65.9%（60/91）,respectively.Conclusion The ESAT-6/CFP-10 fusion protein could be a very useful supplementary tool for the diagnosis of active pulmonary tuberculosis.

Tuberculosis,pulmonary/diagnosis； Recombinant fusion proteins； Enzyme-linked immunosorbent assay； Interferon-gamma release tests

2013-09-12）

（本文編輯：薛愛華）

首都醫(yī)學(xué)發(fā)展科研基金（20093147）

101149首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院結(jié)核三科北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所

陳效友,Email：chenxy1998@hotmail.com