李鵬成， 孫 冰， 喬緒穩(wěn)， 鄭其升， 侯繼波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院，國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京 210014)

乳球菌外殼-蛋白錨定系統(tǒng)是一種新型的疫苗 載運系統(tǒng)。乳球菌外殼實際上是經(jīng)過熱酸處理后得到的球形肽聚糖基質(zhì)(Gram-positive enhancer matrix，GEM)，表面通過一種肽聚糖錨鉤蛋白(Protein anchor，PA)實現(xiàn)裝載抗原蛋白，可用于多種(細菌、寄生蟲、病毒)抗原遞送［1-3］。該系統(tǒng)由食品級遺傳元件組成，生物安全性好，此外，不需要抗原純化，可極大降低制造成本，現(xiàn)已成為生物制品等領域的研究熱點，應用前景廣闊。

肽聚糖錨鉤蛋白PA來自乳酸乳球菌主要自溶素AcmA的C-端［4］。AcmA是乳酸乳球菌的一種主要肽聚糖水解酶，主要與細胞分離和穩(wěn)定期細胞消融有關，參與細胞分裂和穩(wěn)定期時的菌體自溶過程［5］。AcmA一般由1個具有催化活性的N-末端結構域和1個具細胞壁錨定活性的C-末端結構域(cA結構域)組成。天然的cA結構域包含3個被異源性序列間隔開的LysM(Lysin motif)，每個LysM由45個氨基酸殘基組成，且高度同源，也被稱為重復序列(Repeats)。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸乳球菌AcmA突變菌株中2個LysM同樣具有錨定活性［6］。

目前，肽聚糖錨鉤蛋白PA大腸桿菌原核表達相關研究國內(nèi)外尚未見報道。因此，本試驗擬以錨鉤蛋白PA為研究對象，分別設計2個與3個LysMs，應用PCR技術擴增得到乳酸乳球菌LysMs基因片段;然后構建pET-32a(+)-2(3)LysMs原核表達載體，將其轉化大腸桿菌BL-21(DE3)，進行誘導表達，最后進行融合蛋白的純化及錨定活性鑒定。為今后該蛋白多克隆抗體制備及與目的抗原的融合表達等相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與載體 乳酸乳球菌MG1363，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;大腸桿菌工程菌DH5α、BL21(DE3)均為國家獸用生物制品工程技術研究中心實驗室保存，pET32a(+)原核表達載體也為該實驗室保存。

1.1.2 工具酶及主要試劑 反轉錄酶、隨機引物與d(T)引物;限制性內(nèi)切酶 Xho I、EcoR I及其反應緩沖液;PCR反應所需的Ex Taq酶、R Taq酶、dNTP、Ex Taq buffer、PCR buffer、鎂 離 子;pMD18-T載體，T載體連接Buffer;DNA連接酶，DNA連接Buffer;Mini BEST膠回收試劑盒;瓊脂糖凝膠電泳與SDS-PAGE凝膠電泳Marker與buffer均購自大連TaKaRa公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。GM17培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基均由本實驗室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 LysMs基因的擴增 提取乳酸乳球菌MG1363細菌總RNA，然后應用隨機引物與d(T)引物反轉錄獲得cDNA，最后應用PCR方法擴增獲取目的基因。

引物設計:根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中乳酸乳球菌MG1363的AcmA及質(zhì)粒pET32a(+)的載體序列，設計特異性PCR引物，引物由上海英駿生物技術有限公司合成。設計引物如下，2LysMs序列上游引物:5'-CCGGAATTCACTACTTATACCGTCAA ATC-3';下游引物:5'-CCGCTCGAGCTATGAAACAATAAGATTTTGA-3'。3LysMs序列上游引物:5'-CCGGAATTCACTACTTATACCGTCAAATC-3';下游引物:5'-CCGCTCGAGTTATTTTATTCGTAGA TACTGAC-3'(下劃線為限制性酶切位點)。

以上擴增的目的基因上游引物加入的酶切位點均為EcoR I，下游引物加入的酶切位點均為Xho I。PCR反應條件為:95℃預變性5 min;94℃變性30 s，48℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用UVP凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.2 LysMs基因的克隆 參考分子克隆的方法將PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T載體以適當比例混合，加入連接酶I(Solution I)于16℃反應2 h，轉化連接產(chǎn)物至DH5α感受態(tài)細胞中，均勻涂布于含相應抗生素(100 μg/ml)的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色單菌落擴大培養(yǎng)后，用SDS堿裂解法小量提取質(zhì)粒［pMD18-T-2(3)LysMs］。經(jīng)Xho I和EcoR I限制性雙酶切鑒定，初步鑒定為陽性的克隆送上海英駿生物技術有限公司進行測序鑒定。

1.2.3 原核表達載體的構建及表達菌株的獲得 用Xho I和EcoR I分別雙酶切經(jīng)鑒定正確的pMD18-T-2(3)LysMs重組質(zhì)粒和 pET-32a(+)表達載體，回收目的基因和載體片段，加入 T4 DNA連接酶，16℃水浴連接過夜，構建重組質(zhì)粒pET-32a(+)-2LysMs與 pET-32a(+)-3LysMs，將連接產(chǎn)物轉入BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，并涂布于含氨芐(100 μg/ml)的 LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取白色單菌落擴大培養(yǎng)后，用SDS堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確，即獲得陽性表達菌株。

1.2.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導表達 將含有pET-32a(+)-2LysMs與pET-32a(+)-3LysMs重組質(zhì)粒的BL21表達宿主菌，37℃培養(yǎng)過夜后，取此培養(yǎng)物按1%體積比接種于加入氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)2～3 h，OD600為0.5時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)，分別于誘導后 0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 各取 1 ml菌液;同時用未插入目的基因的pET32a質(zhì)粒轉化BL21大腸桿菌，獲得空載體對照菌。將取樣菌液處理后，12%SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 融合蛋白表達形式鑒定 取方法1.2.4中確定最佳誘導時間誘導的重組表達菌10 ml，離心收集菌體，將1/10菌液體積的PBS重懸沉淀，冰浴下超聲波破碎菌體，離心收集上清和沉淀，經(jīng)12%SDS-PAGE分析，觀察蛋白質(zhì)的分布情況。

1.2.6 融合蛋白的純化與復性 試驗發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要出現(xiàn)于沉淀部分，提示目的蛋白以不溶性包涵體形式存在。沉淀加入洗滌液Ⅰ(1 mol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%Triton-100)室溫作用20 min，12 000 r/min離心 10 min，棄上清，再加入洗滌液Ⅱ(1 mol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，3 mol/L尿素，0.5%Triton-100)室溫作用20 min，12 000 r/min離心10 min。洗滌后的包涵體用變性液(1 mol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，6 mol/L鹽酸胍，5%甘油，5 mmol/L DTT)溶解，12 000 r/min離心10 min取上清。

融合蛋白的復性采用透析復性法。以變性液稀釋上清，使蛋白質(zhì)終濃度≤100 μg/ml，將稀釋液轉移到透析袋中，依次在含有 4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L、0 mol/L鹽酸胍的復性緩沖液(20 mmol/L Tris-Cl，500mmol/L NaCl，1mmol/L GSH，0.1 mmol/L GSSG，pH 8.0)中透析復性24 h，并加入0.5 mol/L L-精氨酸。最后在PBS緩沖液中透析2次，每次4 h。經(jīng)聚乙二醇(PEG20000)濃縮至適當體積，4℃、12 000 r/min離心10 min后，取上清，進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.7 GEM顆粒的制備 乳酸乳球菌MG1363在新鮮GM17培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)過夜，6 000 r/min下離心5 min，收集菌體，滅菌純水洗滌1次，然后用1/5體積0.1 mol/L的HCl重懸，煮沸30 min，PBS洗滌 3次，計數(shù)，以 2.5×109為 1 U，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 融合蛋白與GEM顆粒的結合及鑒定 將500 μl(1 mg/ml)復性的目的蛋白與1 U GEM顆粒室溫孵育30 min，6 000 r/min下離心5 min，收集沉淀。PBS洗滌3次，經(jīng)Western-blot鑒定其結合效果。Western-blot試驗步驟:取收集的沉淀用適量PBS重懸后12%SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉移至PVDF膜上;5%脫脂乳室溫封閉1 h，加鼠His單克隆抗體(1∶10 000)，4℃過夜;TBST洗膜3次，每次10 min，再加HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000)，膜室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后應用DAB顯示蛋白質(zhì)條帶。

2 結果

2.1 PCR 擴增

GM1363菌體總RNA進行RT-PCR反應后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得2LysMs特異性條帶，大小為363 bp(圖1A);獲得3LysMs特異性條帶，大小為585 bp(圖1B)?；厥掌谓?jīng)公司測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，序列結果完全一致。

圖1 LysMs基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of the LysMs gene

2.2 重組表達質(zhì)粒鑒定

重組表達質(zhì)粒pET-32a(+)-2LysMs與pET-32a(+)-3LysMs經(jīng)Xho I和EcoR I分別限制性雙酶切，結果如圖2所示，其中約5 900 bp為酶切載體大小，363 bp與585 bp為DNA目的片段大小。

圖2 pET32a(+)-LysMs陽性質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Identifications of recombinant plasmid pET32a(+)-LysMs by enzyme digestion

2.3 融合蛋白的誘導表達

如圖3所示，含有 pET-32a(+)-2LysMs、pET-32a(+)-3LysMs與 pET-32a(+)的 BL21菌體經(jīng)IPTG誘導后收集菌體，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分析，誘導的pET-32a(+)菌體有一處不同于未轉入質(zhì)粒的細菌的特異性條帶，即載體蛋白質(zhì)的大小約為20 000。含有pET-32a(+)-2LysMs的菌體表達32 000大小的特異性條帶，即肽聚糖錨鉤融合蛋白。表明含有2個LysMs的肽聚糖錨鉤蛋白相對分子量約為12 000。從IPTG不同誘導時間發(fā)現(xiàn)，pET-32a(+)-2LysMs菌體表達的融合蛋白表達量在1～2 h達到最大值，之后目的蛋白量逐漸減少。含有pET-32a(+)-3LysMs的菌體經(jīng)同樣方法誘導后未見融合蛋白表達。本試驗獨立重復3次，結果一致。

圖3 重組pET-32a(+)-2LysMs表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結果Fig.3 SDS-PAGE of recombinant pET-32a(+)-2LysMs expressed in E.coli

2.4 融合蛋白表達形式

將含有pET-32a(+)-2LysMs菌體IPTG誘導后收集菌體超聲破碎后，分別收集上清和沉淀，SDSPAGE分析，可見沉淀中有明顯的融合蛋白特異性條帶，而上清中無特異性條帶(圖4)，表明融合蛋白主要以包涵體形式表達。

圖4 pET-32a(+)-2LysMs原核表達產(chǎn)物的分布Fig.4 Prokaryotically expressed protein of pET-32a(+)-2LysMs in E.coli

2.5 融合蛋白的復性及錨定活性鑒定

融合蛋白經(jīng)鹽酸胍復性，12%SDS-PAGE分析得到較純的PA融合蛋白(圖5)。經(jīng)Western blot鑒定，復性后的PA融合蛋白可與GEM顆粒結合，表明該蛋白質(zhì)具有良好的錨定活性(圖6)。

圖5 pET-32a(+)-2LysMs原核表達產(chǎn)物的純化Fig.5 Purification of prokaryotically expressed protein of pET-32a(+)-2LysMs in E.coli

圖6 融合蛋白與GEM顆粒結合Western blot鑒定Fig.6 The anchoring between the fusion protein and GEM(gram-positive enhancer matrix)identified by Western blot

3 討論

目前，已報道的用于表達PA融合蛋白的宿主菌只有乳酸乳球菌一種［3，6-8］。肽聚糖錨鉤蛋白PA來自乳酸乳球菌自溶素AcmA的C-端結構域，該結構域的3個LysMs序列重復單元之間的間隔序列，是由豐富的絲氨酸、蘇氨酸與天冬氨酸組成［9］。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸乳酸菌細胞中的蛋白酶HtrA可以對這些間隔氨基酸進行剪切從而降解AcmA的C-端結構域。此外，AcmA缺失乳球菌可使細菌形成長鏈，增加宿主菌PA的表達量［3］。因此，國外構建的表達PA宿主菌大都為HtrA與AcmA雙缺失的乳酸乳球菌［3，6-8］。應用自身宿主菌表達 PA蛋白可確保PA具有更高的錨定活性。然而，由于乳酸乳球菌屬于革蘭氏陽性菌，外源基因的轉化表達較難，其次蛋白表達產(chǎn)量也較低。因此，基因操作技術更為成熟的大腸桿菌表達系統(tǒng)能否表達PA融合蛋白，成為本試驗提出的新命題。

本試驗中分別構建了pET-32a(+)-2LysMs與pET-32a(+)-3LysMs原核表達載體，但研究發(fā)現(xiàn)僅有pET-32a(+)-2LysMs表達載體在表達宿主菌BL-21大腸桿菌中得到表達，而pET-32a(+)-3LysMs重組質(zhì)粒宿主菌經(jīng)各種條件優(yōu)化誘導，也未能表達目的蛋白。乳酸乳球菌HtrA缺失株作為宿主菌，可以防止宿主HtrA對PA的剪切，確保正常分泌;而大腸桿菌體內(nèi)可能存在HtrA相似的酶類，可剪切間隔序列中的氨基酸，致使3個LysMs重復結構域的目的蛋白被降解而得不到表達。此外，通常原核表達形成包涵體形式的目的蛋白，在5 h內(nèi)表達量都很高。而本試驗中pET-32a(+)-2LysMs重組質(zhì)粒轉化宿主菌誘導后，目的蛋白的表達量在1～2 h時最多，之后逐漸減少，這是否與間隔序列被逐漸破壞，目的蛋白不斷被降解有關尚未可知。2個LysMs重復序列表達出的目的蛋白肽鏈較短，比3個LysMs序列少了一個間隔序列，為什么該目的蛋白沒有被完全降解?這些問題都有待進一步研究。

對融合蛋白的表達形式分析后，結果表明，所表達的PA融合蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在。經(jīng)變性復性后的PA蛋白可與GEM顆粒相結合，表明大腸桿菌原核表達獲得的PA融合蛋白同樣具有肽聚糖錨定活性。包涵體形式便于表達產(chǎn)物的純化，本研究也獲得了較純的PA融合蛋白。包涵體的缺點是需要超聲破碎菌體，再經(jīng)裂解、洗滌、變性、復性等復雜處理才可得到可溶性蛋白［10-11］。

本研究成功構建了 pET-32a(+)-2LysMs與pET-32a(+)-3LysMs原核表達載體，誘導大腸桿菌獲得了較純的含有2個LysMs的、具有良好錨定活性的PA融合蛋白質(zhì)，為今后PA蛋白多克隆抗體制備及與目的抗原的融合表達等相關研究奠定了基礎。

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