任向榮， 李 偉， 孫海燕， 陳懷谷， 于漢壽

(1.南京農業(yè)大學生命科學院，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

由禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis Van der Hoeven)引起的小麥紋枯病已成為中國小麥主產區(qū)小麥高產、穩(wěn)產的重要威脅［1－2］。該菌通常以菌絲和菌核的形態(tài)習居于土壤中，自然條件下只發(fā)現(xiàn)無性世代［3－5］。國內外學者對禾谷絲核菌的田間快速檢測、化學防治及生物防治等方面做了大量研究［6－10］。但對該病原菌的流行學、基因之間的交流和致病機理等方面的研究遠遠落后于其他一些病原菌，其主要原因是到目前為止尚未建立禾谷絲核菌有效的遺傳轉化體系，而制備高質量的與原始菌株遺傳背景一致的原生質體是進行遺傳轉化的前提。

原生質體是通過機械破碎或酶消解細胞壁而得到的裸露細胞，質膜為細胞質和外界環(huán)境間的唯一屏障，對外界環(huán)境的變化非常敏感。因此，原生質體常被用于生化分析［11］、細胞壁再生過程觀察［12］、發(fā)育學的研究［13］、標記蛋白質的細胞定位［14］、蛋白質間關系的分析［15－16］以及染色體的改造［17］等。另外，原生質體是絲狀真菌細胞融合、誘變育種和遺傳轉化等的理想材料。隨著分子生物學技術在植物病理學研究中的不斷應用和發(fā)展，真菌的遺傳轉化越來越受到重視。目前，已有100多種真菌實現(xiàn)了遺傳轉化［18］。絲狀真菌的遺傳轉化方法有多種，包括PEG－原生質體轉化和農桿菌介導轉化法 (Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT)等。

有研究結果表明多核的立枯絲核菌(R.solani)原生質體再生菌株無論從形態(tài)、生長速率還是分子水平上都與原始菌株有較大差異［19］，這一現(xiàn)象對進一步的遺傳轉化等是不利的。禾谷絲核菌細胞為雙核，其原生質體的制備方法，再生菌株與原始菌株之間是否存在差異，以及遺傳轉化體系的構建等研究目前尚未見報導。本研究采用多種酶消解菌絲細胞壁的方法探索禾谷絲核菌原生質體的制備方法，比較原生質體再生菌株和原始菌株在形態(tài)、生長速率、致病力及遺傳組成等方面的差異，并利用PEG－原生質體的轉化和土壤農桿菌介導的轉化等方法嘗試構建禾谷絲核菌的遺傳轉化體系，為進一步研究其致病機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 原生質體制備

采用4種方法獲得用于酶解的菌絲:(1)直接從PSA平板上挑取一定量的禾谷絲核菌R0301菌株(該菌株分離自江蘇省南京市，是強致病力菌株，保藏于江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所)的氣生菌絲;(2)參照張穎等［20］的方法并有所改進，將挑取的氣生菌絲在研缽中研磨后轉移到液體TB3(0.3%酵母浸提物，0.3%蛋白胨和20%蔗糖)培養(yǎng)基中，28℃再培養(yǎng)44 h左右，過濾收集菌絲并用無菌水沖洗;(3)參照Liu等［21］的獲取菌絲的方法，在鋪有玻璃紙的PDA平板上28℃培養(yǎng)44 h左右，將玻璃紙連菌碟一起放進無菌水中從而分離獲得菌絲;(4)PDA平板上培養(yǎng)3～5 d后，在菌落邊緣打菌碟，轉移到鋪有玻璃紙的PDA平板上28℃再培養(yǎng)44 h左右，用金屬小勺柄或接種針刮取菌絲，該方法是對第3種方法的改良。

將收集得到的菌絲等量轉入含2%消化酶(分別是纖維素酶、裂解酶、崩潰酶及溶壁酶)的10 ml 0.7 mol/L滲透壓穩(wěn)定劑(山梨醇、蔗糖、NaCl和MgSO4)中，在30℃、120 r/min條件下酶解。每間隔0.5 h進行顯微鏡檢測。酶解0.5～3.0 h后，3層過濾膜過濾收集原生質體。

1.2 原生質體的計數(shù)、核染色及再生

用STC(15%山梨醇，0.7%CaCl2·H2O和5%Tris/HCl，pH 8.0)溶解原生質體沉淀，進行一定的稀釋后計數(shù);用10 μg/ml核熒光染料Hoechst 33258(碧云天生物技術研究所產品)對菌絲和原生質體處理5 min后，熒光顯微鏡(Nikon ECLIPSE E400)下觀察核染色情況;將一定量的原生質體加入已冷卻至室溫的RM(1.6 mol/L蔗糖，0.4%干酪素水解物，0.4%酵母浸提物和0.85%的瓊脂粉)固體培養(yǎng)基中，輕輕混勻后倒平板;28℃培養(yǎng)6～7 d后，挑取再生培養(yǎng)基上的單菌落，轉接到PDA平板上28℃培養(yǎng)，觀察它們與原始菌株在形態(tài)和生長速率等方面的差異。

1.3 原生質體再生菌株致病力測定

試驗選小麥品種揚麥158，將種子播種于裝有滅菌土、口徑為8 cm的塑料盆缽中，每缽播25粒，并蓋上滅菌土。在人工氣候培養(yǎng)箱內20℃培養(yǎng)，待小麥長到二葉期在莖基部接入直徑為0.5 cm的菌碟，每個菌株3個重復，接種14 d后參照 Lipps等［22］的分級標準調查病情。計算病情指數(shù)，使用DPSv7.05軟件對病情指數(shù)進行統(tǒng)計分析。

1.4 菌株DNA的提取及AFLP差異分析

從200個再生菌株中隨機選取100株進行差異分析。菌株DNA的提取采用快速基因組DNA試劑盒(東盛生物公司產品)。AFLP試驗方法參照Ceresini等［23］和 Vos 等［24］的方法，預擴增引物為EcoRI+G(5'－GACTGCGTACCAATTCG－3')和 MseI+G(5'－GATGAGTCCTGAGTAAG－3')，選擇性擴增引物為 EcoRI+GT(5'－GACTGCGTACCAATTCGT－3')和 MseI+GT(5'－GATGAGTCCTGAGTAAGT－3')。AFLP選擇性擴增產物變性后在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，硝酸銀染色顯影。

1.5 遺傳轉化

1.5.1 測定禾谷絲核菌對潮霉素B的敏感濃度設置潮霉素 B 濃度梯度為:0 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml，測定禾谷絲核菌對潮霉素B的敏感濃度。

1.5.2 PEG－原生質體轉化 按照方法1.1獲得的原生質體沉淀，1 ml STC溶解，轉入2 ml離心管中;5 000 r/min離心5 min，棄上清;STC懸浮原生質體;轉化液:90 μl STC+10 μl質粒 +100 μl原生質體，使原生質體數(shù)達到104個、105個和106個，輕輕混勻，室溫靜置20 min;加1 ml SPTC(STC+50%PEG)輕輕混勻，室溫靜置20 min;加5 ml TB3混勻，18℃，121 r/min搖培過夜;第2 d倒制平板，先加入一定體積的潮霉素B到RM培養(yǎng)基中，再倒入過夜的轉化液，混勻后倒平板;倒置，28℃培養(yǎng)。

1.5.3 土壤農桿菌(A.tumefaciens)AGL－1介導的轉化 從新鮮培養(yǎng)的LB平板上挑取土壤農桿菌AGL－1的單菌落，接種到5 ml液體LB培養(yǎng)基中(含50 μg/ml的卡那霉素)，200 r/min，28 ℃ 下過夜培養(yǎng);將 200 μl上述培養(yǎng)液轉移到5 ml含50 μg/ml卡那霉素的誘導培養(yǎng)基(IM)中，OD600值約為0.15，加入乙酞丁香酮(AS)，濃度為 200 μg/ml，28 ℃ 培養(yǎng)5～6 h使OD600達到0.5～0.6;用TB3懸浮原生質體沉淀;取100 μl經(jīng)處理的農桿菌菌液和100 μl原生質體，使原生質體數(shù)達到104個、105個和106個，混勻后輕輕涂布在含200 μg/ml乙酞丁香酮(AS)的IM固體平板上的玻璃紙上，22℃黑暗培養(yǎng)48 h;把玻璃紙倒置轉移到選擇培養(yǎng)基上(PSA+50 μg/ml潮霉素 B+400 μg/ml頭孢氨芐 +60 μg/ml鏈霉素)，28℃黑暗培養(yǎng)。

2 結果與分析

2.1 菌絲獲得方法及細胞壁消解酶和滲透壓穩(wěn)定劑處理對原生質體制備的影響

在以溶壁酶為消解酶和以0.7 mol/L NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑的酶解體系中，4種不同方法獲得的菌絲用于制備原生質體，得到的原生質體量有很大差異。方法(1)得到的原生質體數(shù)為1 ml 101～102個;方法(2)得到的原生質體數(shù)為1 ml 0.5×102～1.5×102個;方法(3)制備的原生質體數(shù)達到1 ml 5×103～104個;方法(4)得到的幼嫩菌絲制備原生質體時，原生質體數(shù)達到1 ml 106個。而其他消解酶和滲透壓穩(wěn)定劑組合的體系中，沒有觀察到原生質體出現(xiàn)。

采用方法(4)得到的幼嫩菌絲，用0.7 mol/L NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑，濃度為2.0%的4種消化酶處理，每間隔0.5 h檢測。直到酶解3 h時，在含崩潰酶、纖維素酶和裂解酶3種酶的酶解體系中都沒有原生質體出現(xiàn);而在溶壁酶的酶解體系中，0.5 h就發(fā)現(xiàn)大量的原生質體(圖1)。結果表明，在本試驗條件下，崩潰酶、纖維素酶和裂解酶3種酶對禾谷絲核菌的細胞壁幾乎沒有消解能力而不能釋放原生質體，溶壁酶對禾谷絲核菌的細胞壁的降解起著非常重要的作用。

圖1 4種滲透壓穩(wěn)定劑對原生質體釋放的影響Fig.1 Four kinds of osmotic pressure stabilizers influencing protoplast liberation

同種酶的作用下，不同的滲透壓穩(wěn)定劑對原生質體的釋放有很大影響。崩潰酶、纖維素酶和裂解酶3種酶分別在山梨醇、蔗糖、NaCl和MgSO4中酶解直到3 h都沒有原生質體出現(xiàn)。在以溶壁酶為細胞壁消解酶的作用體系中，直到酶解3 h，以山梨醇為滲透壓穩(wěn)定劑的體系中原生質體的釋放量幾乎都為零;而以蔗糖、NaCl和MgSO4為滲透壓穩(wěn)定劑的體系中，酶解0.5 h 1 ml原生質體數(shù)已達到105。以蔗糖滲透壓穩(wěn)定劑的體系中原生質體釋放量低于以NaCl和MgSO4為滲透壓穩(wěn)定劑的體系(圖1)。無機鹽滲透壓穩(wěn)定劑NaCl和MgSO4比有機物滲透壓穩(wěn)定劑更有利于禾谷絲核菌原生質體的釋放，NaCl尤其明顯。酶處理1.5 h時，在NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑的體系中，1 ml原生質體數(shù)達到106，但隨著時間的延長原生質體數(shù)并沒有增加反而越來越少(圖1)。長時間的酶處理可能對原生質體有一定的破壞作用。因此，禾谷絲核菌菌絲酶解處理1.5 h左右是收集原生質體的相對最佳時間。

2.2 原生質體核染色、萌發(fā)及再生

所制備的原生質體純化濃縮后鏡檢呈規(guī)則的球形，大小不一，并有聚集現(xiàn)象(圖2a)。原生質體在液體培養(yǎng)基中的萌發(fā)類似孢子，先長出牙管，慢慢伸長，長到一定長度開始分叉并小于90°(圖2b～d)。在再生培養(yǎng)基(RM)上培養(yǎng)7 d后長出單一分散的白色菌落(圖2e)。對菌絲及原生質體細胞核進行染色和鏡檢，觀察到菌絲及原生質體的細胞核數(shù)目一致，均為雙核(圖3)。把再生培養(yǎng)基上(圖2e)的單一菌落轉接到普通PDA培養(yǎng)基上生長，隨機挑取部分原生質體再生菌株，共200株，再生菌株在形態(tài)上與原始菌株沒有差異。

圖2 禾谷絲核菌的原生質體萌發(fā)及再生Fig.2 The protoplast germination and regeneration of R.cerealis

圖3 菌絲及原生質體的細胞核Hoechst 33258染色Fig.3 Nuclear staining of hypha and protoplasts with Hoechst 33258

2.3 再生菌株的生長速率及致病力分析

從100個再生菌株(用于后面的AFLP試驗)中隨機挑選15株，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測定其生長速率，結果表明原生質體再生菌株與原始菌株的生長速率無顯著差異(圖4a)。對原始菌株R0301和15個再生菌株進行了致病力測定，病情指數(shù)調查結果表明，15個禾谷絲核菌再生菌株的致病力沒有明顯差異，與原始菌株的差異也不顯著(圖4b)。

圖4 禾谷絲核菌原始菌株和原生質體再生菌株生長速率(a)及致病力(b)比較Fig.4 The growth rate(a)and pathogenicity(b)of regenerated and original strains of R.cerealis

2.4 原生質體再生菌株的AFLP差異分析

隨機選擇了100個再生菌株，提取其基因組DNA。通過AFLP分子標記差異分析共得到20個片段，分布在50 bp～2 000 bp之間。電泳結果表明再生菌株之間不存在多樣性，再生菌株與原始菌株之間也沒有差異(圖5)。

圖5 原生質體再生菌株的AFLP分子標記Fig.5 The analysis of protoplast regenerated strains by AFLP

2.5 遺傳轉化體系

潮霉素B濃度為50 μg/ml時，對禾谷絲核菌的抑制率已經(jīng)達到了100%(表1)。因此，選擇轉化子的潮霉素B濃度為50 μg/ml。原生質體數(shù)量為104個、105個和106個時，分別采用 PEG－原生質體轉化和農桿菌介導的原生質體轉化，多次嘗試沒有獲得轉化子。針對禾谷絲核菌的遺傳轉化，通過多次探究沒有成功建立其遺傳轉化體系。

表1 禾谷絲核菌R0301對潮霉素B的敏感性Table 1 The susceptibility of R.cerealis R0301 to hygromycin B

3 討論

原生質體是遺傳轉化、融合、誘變育種、觀察細胞壁構成及了解內生病毒傳播情況等的理想材料，有助于探索絲狀真菌的生化特性及遺傳學及生理學研究等［19］。原生質體的制備與很多因素有關，如酶的種類、滲透壓穩(wěn)定劑、酶作用時間及溫度和菌齡等。

一般處于對數(shù)生長期的真菌幼嫩菌絲用于酶解制備原生質體效果最好［25］。幼嫩菌絲的獲得對原生質體的制備也非常關鍵。禾谷絲核菌在實驗室培養(yǎng)條件下不產生孢子［3］，所以不能像大多數(shù)產孢真菌那樣通過孢子萌發(fā)獲得幼嫩菌絲。培養(yǎng)長時間之后的氣生菌絲質地過密且已老化，去壁較難不適于原生質體的制備。采用從鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上獲得的幼嫩菌絲用于酶解，可得到大量的原生質體，并且方法簡單易行，耗時短。

原生質體的制備很大程度上依賴細胞壁消解酶的選擇，而細胞壁消解酶的選擇又和該菌的細胞壁組成相關。禾谷絲核菌是一種擔子菌，它的細胞壁主要成分是葡聚糖、幾丁質等［26］。纖維素不是禾谷絲核菌的細胞壁主要成分，單一的纖維素酶對禾谷絲核菌幾乎沒有消化作用。崩潰酶(Driselase)和裂解酶(Lysing enzymes)是立枯絲核菌的高效細胞壁消解酶［21］，在本試驗中，它們對禾谷絲核菌的細胞壁幾乎都沒有消解作用。禾谷絲核菌同立枯絲核菌在胞壁組成上可能存在一定的差異。

滲透壓穩(wěn)定劑可維持原生質體細胞膜內外的滲透壓平衡，也影響酶的活性［27］。不同的細胞壁消化酶在作用同一底物時，也會有它們適宜的滲透壓穩(wěn)定劑。崩潰酶、纖維素酶和裂解酶3種酶分別在山梨醇、蔗糖、NaCl和MgSO44種滲透壓穩(wěn)定劑中都沒有原生質體出現(xiàn)，溶壁酶在本試驗所用的滲透壓穩(wěn)定劑(除山梨醇外)中都有大量原生質體產生。無機鹽滲透壓穩(wěn)定劑特別是NaCl更有利于禾谷絲核菌原生質體的產生。

顯微鏡下的原生質體呈規(guī)則的球形，并存在聚集現(xiàn)象。有研究結果表明原生質體通過細胞壁的殘余物質粘連，這一現(xiàn)象有助于原生質體的細胞壁復原及再生。Liu等［28］制備立枯絲核菌的原生質體，恢復原生質體細胞壁可制成人工孢子。在實驗室培養(yǎng)條件下，禾谷絲核菌也不產生任何有性或無性孢子，利用立枯絲核菌制造人工孢子的原理，可能得到禾谷絲核菌的人工孢子，用于篩選禾谷絲核菌的殺菌劑和抗病小麥品種等。另外，根據(jù)產孢菌單孢分離的方法，進行單原生質體分離［29］，可以對不產孢的禾谷絲核菌進行菌株純化等應用。

制備得到的原生質體與原始菌株的遺傳背景一致是進行遺傳轉化、誘變育種等的前提。Thomas等［19］的研究結果表明立枯絲核菌的原生質體不僅細胞核數(shù)目不同，而且生長速率和形態(tài)都有很大差異。本研究通過細胞核染色發(fā)現(xiàn)，制備的禾谷絲核菌原生質體都以雙核的形式存在，與原始菌株菌絲細胞內的核數(shù)目一致。再生菌株的形態(tài)、生長速率等與原始菌株也沒有差異。AFLP分子標記檢測的結果表明，禾谷絲核菌原生質體再生菌株之間遺傳組成可能沒有差異，并且與原始菌株之間也可能無差異。致病力測定結果也顯示原生質體再生菌株與原始菌株之間無顯著性差異。以上結果表明，禾谷絲核菌再生菌株和原始菌株之間幾乎不存在差異，我們的制備體系沒有改變原始菌株的遺傳背景。本研究建立的體系可制備大量的與原始菌株遺傳背景一致的原生質體，可用于轉化及誘變等一系列遺傳操作。

本試驗通過多次嘗試PEG－原生質體轉化和土壤農桿菌介導的轉化，沒有成功建立禾谷絲核菌遺傳轉化體系?？赡茉蚴?，在實驗室培養(yǎng)條件下，禾谷絲核菌不產生任何有性或無性孢子，并且細胞內存在雙核等［3］。這些現(xiàn)象對禾谷絲核菌遺傳轉化體系的建立都是非常不利的。另一方面，已經(jīng)嘗試的轉化方法或轉化條件可能不適合禾谷絲核菌的轉化。關于絲核菌屬的遺傳轉化體系，國內外很少有成功的報道，主要原因是很難發(fā)現(xiàn)絲核菌的有性態(tài)生活階段，無性態(tài)又不產生任何孢子，同時絲核菌屬的細胞內存在多核現(xiàn)象等［3］。對于絲核菌屬的遺傳轉化體系的建立有待于人們繼續(xù)研究。

［1］LIU H X，XIN Z Y，ZHANG Z Y.Changes in activities of antioxidant－related enzymes in leaves of resistant and susceptible wheat inoculated with Rhizoctonia cerealis［J］.Agricultural Sciences in China，2011，10(4):526－533.

［2］孔凡彬，李衛(wèi)海，徐瑞富，等.井岡霉素與其他幾種殺菌劑混配對禾谷絲核菌的室內毒力［J］.江蘇農業(yè)科學，2011，39(1):129－131.

［3］GONZáLEZ G V，PORTAL O M A，SUSAN V R.Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia ［J］.Spanish Journal of Agricultural Research，2006，4(1):55－79.

［4］SHARON M，KUNINAG S，HYAKUMACHI M，et al.Classification of Rhizoctonia spp.using rDNA－ITS sequence analysis supports the genetic basis of the classical anastomosis grouping ［J］.Mycoscience，2008，49:93－114.

［5］陳 瑩，李 偉，張曉祥，等.我國北緯33度地區(qū)小麥紋枯病病原菌組成及其致病力研究［J］.麥類作物學報，2009，29(6):1110－1114.

［6］GUOY P，LI W，SUN H Y，et al.Detection and quantification of Rhizoctonia cerealis in soil using real－time PCR ［J］.Journal of General Plant Pathology，2012，78(4):247－254.

［7］陳懷谷，方 正，陳厚德，等.小麥紋枯病的分子檢測［J］.植物保護學報，2005，32(3):261－265.

［8］SCHROEDER K L，PAULITZ T C.Root diseases of wheat and barely during the transition from conventional tillage to direct seeding［J］.Plant Disese，2006，90(9):1274－7253.

［9］HAMADA M S，YIN Y N，MA Z H.Sensitivity to iprodione，difenoconazole and fludioxonil of Rhizoctonia cerealis isolates collected from wheat in China ［J］.Crop Protection，2011，30:1028－1033.

［10］WEN C Y，YIN Z G，WANG K X，et al.Purification and structural analysis of surfactin produced by endophytic Bacillus subtilis EBS05 and its antagonistic activity against Rhizoctonia cerealis［J］.The Plant Pathology Journal，2011，27(4):342－348.

［11］SHEAHAN M B，ROSE R J，MCURDY D W.Actin－filament－dependent remodeling of the vacuole in cultured mesophyll protoplasts［J］.Protoplasma，2007，230:141－152.

［12］YANG X Y，TU L L，ZHU L F，et al.Expression profile analysis of genes involved in cell wall regeneration during protoplast culture in cotton by suppression subtractive hybridization and macroarray［J］.Journal of Experimental Botany，2008，59(13):3661－3674.

［13］PETERSSON S V，JOHANSSON A I，KOWALCZYK M，et al.An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high－resolution cell－specific analysis of IAA distribution and synthesis［J］.The Plant Cell，2009，21:1659－1668.

［14］LOOCK B V，MARKAKIS M N，VERBELEN J P，et al.Highthroughput transient transformation of Arabidopsis roots enables sys－tematic colocalization analysis of GFP－tagged proteins［J］.Plant Signaling and Behavior，2010，5(3):261－263.

［15］WU F H，SHEN S C，LEE L Y，et al.Tape－Arabidopsis Sandwich－a simpler Arabidopsis protoplast isolation method［J］.Plant Methods，2009，5(16):1－10.

［16］FARACO M，SANSEBASTIANO G P D，SPELT K，et al.One protoplast is not the other［J］.Plant Physiology，2011，156:474－478.

［17］HARA S，JIN F J，TAKAHASHI T，et al.A further study on chromosome minimization by protoplast fusion in Aspergillus oryzae［J］.Molecular Genetics and Genomics，2012，287:177－187.

［18］高 靜，李艷波，柯希望，等.PEG介導的蘋果腐爛病菌原生質體轉化［J］. 微生物學報，2011，51(9):1194－1199.

［19］THOMAS E，PAKALA S，F(xiàn)EDOROVA N D，et al.Triallelic SNP－mediated genotyping of regenerated protoplasts of the heterokaryotic fungus Rhizoctonia solani［J］.Journal of Biotechnology，2012，10:1－7.

［20］張 穎，王 剛，王美南.小麥全蝕病菌原生質體制備的條件及再生菌株的致病性［J］.微生物學雜志，2005，25(5):29－32.

［21］LIU T H，LIN M J，KO W H.Factors affecting protoplast formation by Rhizoctonia solani［J］.New Biotechnology，2010，27(1):64－69.

［22］LIPPS P E，HERR L J.Etiology of Rhizoctonia cerealis in sharp eyespot of wheat［J］.Phytopathology，1982，72:1574－1577.

［23］CERESINI P C，SHEW H D，VILGALYS R J，et al.Genetic diversity of Rhizoctonia solani AG－3 from potato and tobacco in North Carolina［J］.Mycologia，2002，94(3):437－449.

［24］VOS P，HOGERS R，BLEEKER M，et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting ［J］.Nucleic Acids Research，1995，23:4407－4414.

［25］韓文霞，劉 迪，陳二方，等.氦氖激光、紫外復合誘變天麻素產生菌華根霉LN－A的原生質體［J］.微生物學通報，2009，36(12):1849－1855.

［26］GARCIA S B.Cell wall chemistry，morphogenesis，and taxonomy of fungi［J］.Microbiology，1968，22:87－108.

［27］李伶俐，嚴 紅，李興紅，等.甘藍枯萎病菌原生質體的制備與再生條件的優(yōu)化［J］.中國農學通報，2011，27(10):203－207.

［28］LIU T H，LIN M J，KO W H.Development of artificial conidia for ecological studies of Rhizoctonia solani in soil［J］.New Biotechnology，2011，28(1):86－91.

［29］QU P，ARATANI A，SYOJI T，et al.Use of single－protoplast isolates in the study of the mating phenomena of Rhizoctonia solani(Thanatephorus cucumeris)AG－1 IC and IA ［J］.Mycoscience，2008，49:132－137.