李碧俠， 趙 芳， 付言峰， 王學敏， 方曉敏， 涂 楓， 任守文， 王金玉

(1.揚州大學動物科學技術學院，江蘇 揚州 225009;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所，江蘇 南京 210014)

沉默信息調(diào)控子Sir2(Silent information regulator 2)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白脫乙酰酶，參與異染色質的基因沉默、DNA修復、基因組穩(wěn)定性和低等生物壽命的調(diào)控［1-3］。在各物種中發(fā)現(xiàn)的Sir2同源蛋白統(tǒng)稱為Sirtuins家族，哺乳動物的Sirtuins家族有7個成員(SIRT1～SIRT7)，其中 SIRT1與Sir2的同源性最高，因而受到廣泛關注。對小鼠和人的SIRT1基因研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1基因在機體內(nèi)通過對幾種控制代謝及內(nèi)分泌信號的轉錄因子去乙酰化作用來調(diào)節(jié)能量代謝［4-5］。隨后研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1與生殖激素分泌存在較大相關性，直接或間接參與生殖調(diào)控［6-7］。SIRT1基因在調(diào)節(jié)多種轉錄活性中以一種組織特異性方式發(fā)揮作用，提示SIRT1基因的表達在哺乳動物生理學方面具有廣泛效應。

目前關于豬SIRT1基因的研究報道很少，豬作為一個良好的動物模型，在研究能量代謝、生殖激素調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。卵巢顆粒細胞是目前廣泛用于相關基因研究最有效且成熟的細胞模型。雌激素是促進卵泡發(fā)育成熟、排卵不可缺少的調(diào)節(jié)因素。因此，本研究擬分析激活劑白黎蘆醇和抑制劑尼克酰胺誘導SIRT1基因mRNA表達量的變化對豬卵巢顆粒細胞分泌雌激素的影響及兩者間的相關性，將有助于更好地研究SIRT1基因在豬卵巢卵泡發(fā)育和發(fā)情排卵中的作用，為更深入地研究SIRT1基因影響豬生殖調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗豬由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院六合蘇鐘豬原種場提供，均為蘇鐘豬成年母豬。采集新鮮健康的豬卵巢，置于37℃生理鹽水(添加青霉素和鏈霉素)中，2 h內(nèi)帶回實驗室，用PBS清洗卵巢3～4次，選擇直徑為3～5 mm的卵泡進行顆粒細胞采集。

1.2 試驗方法

1.2.1 主要儀器和試劑 Trizol試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，M-MLV reverse transcriptase為Promega公司產(chǎn)品，DMEM/F-12液體培養(yǎng)基、新生胎牛血清、DPBS為GIBCO公司產(chǎn)品，無 RNase的 dNTPMixture、Buffer、SYBR premix ex Taq TM 為 TaKaRa公司產(chǎn)品，豬雌激素酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自凱基公司。儀器有Bio-Rad Iq5型熒光定量PCR儀、SZ-51連續(xù)變倍體視顯微鏡、Leica倒置熒光顯微鏡和BIO-RAD電泳凝膠成像系統(tǒng)。

1.2.2 顆粒細胞的原代培養(yǎng) 選擇直徑為2～6 mm的大卵泡，用一次性注射器抽取卵泡液，將卵泡液打入15 ml離心管中，離心，棄上清，加入適量PBS懸浮細胞，并吹打至散，離心，取適量DMEM/F-12將細胞沖至懸浮，并吹打均勻，細胞計數(shù)，調(diào)整密度至106CFU/ml;接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶加2～3 ml DMEM/F-12培養(yǎng)基，做好標記，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后觀察細胞貼壁情況，24 h后換液，待細胞密度達90%時將細胞傳代。體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞密度達80%時將培養(yǎng)液更換為DMEM/F-12培養(yǎng)液(激活劑白黎蘆醇或尼克酰胺劑量分 別 為 10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L)，空白對照所用的 DMEM/F-12添加與激活劑劑量相等的DMSO(二甲基亞砜)，培養(yǎng)24 h后，采用qRT-PCR技術對豬卵巢顆粒細胞SIRT1基因的mRNA進行定量分析。每種處理重復3次。收集細胞培養(yǎng)液進行雌激素濃度測定。

1.2.3 SIRT1 mRNA表達量的檢測 根據(jù)GenBank中公布的豬SIRT1基因序列設計引物，擴增片段長度為130 bp，上游引物序列為:5'-ATTCTTGTGAAAGTGATGAGGATG-3'，下游引物序列為:5'-ATTGTTCGAGGATCTGTGCC-3'。管家基因GAPDH的上游引物序列為:5'-TGAAGGTCGGAGTGAACGGAT-3'，下游引物序列為:5'-TGGGTGGAATCATACTGGAAC-3'，擴增片段長度為148 bp。引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。利用Trizol法提取豬卵巢顆粒細胞總RNA，利用紫外分光光度計檢測RNA質量和濃度，進行反轉錄和RT-PCR擴增。

目的基因、管家基因熒光定量PCR程序均為:反應總體積為25.0 μl，包括SYBR premix ex Taq TM 12.5 μl，上、下游正反引物(10 μmol/L)各 0.5 μl，去離子水10.5 μl。設無模板對照。采用兩步法，反應條件均為:94℃ 預變性10 s;然后94℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 15 s，35個循環(huán)。具體方法參照參考文獻［8］。

1.2.4 雌激素濃度的檢測 采用豬雌激素酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測培養(yǎng)液中雌激素的濃度，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，制定標準曲線，標準曲線的結果經(jīng)Logit換算成直線，用直線回歸的方法算出直線方程，再根據(jù)此方程計算出每一樣品的激素含量。

1.2.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行差異顯著性和相關性分析。

2 結果

2.1 不同濃度白黎蘆醇、尼克酰胺對豬卵巢顆粒細胞中SIRT1 mRNA表達量的影響

采用qRT-PCR方法檢測不同濃度白黎蘆醇、尼克酰胺對豬卵巢顆粒細胞中SIRT1 mRNA表達量的影響，結果表明，隨著白黎蘆醇濃度的升高，SIRT1 mRNA表達量逐漸增多，達到最高值后逐漸下降;相反，隨著尼克酰胺濃度的升高，SIRT1 mRNA表達量逐漸減少。培養(yǎng)液中白黎蘆醇濃度低于25 μmol/L及以下時，處理組顆粒細胞中SIRT1 mRNA表達量與空白對照組無顯著差異;白黎蘆醇濃度達到50 μmol/L及以上時，處理組顆粒細胞中SIRT1 mRNA表達量極顯著或顯著高于空白對照組(圖1A)。培養(yǎng)液中尼克酰胺濃度達到50 μmol/L及以上時，處理組顆粒細胞中SIRT1 mRNA表達量極顯著低于空白對照組(圖1B)。

圖1 含不同濃度白黎蘆醇、尼克酰胺的DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞中SIRT1 mRNA的相對表達量Fig.1 SIRT1 mRNA expression levels in porcine ovarian granulosa cells cultured in DMEM/F-12 with different concentrations of resveratrol and nicotinamide

2.2 不同濃度白黎蘆醇、尼克酰胺對豬卵巢顆粒細胞分泌雌激素的影響

采用豬雌激素酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測顆粒細胞培養(yǎng)液中雌激素的濃度。隨著白黎蘆醇濃度的升高，培養(yǎng)液中雌激素濃度逐漸升高，達到最高值后，逐漸下降(圖2A);相反，隨著尼克酰胺濃度的升高，培養(yǎng)液中雌激素濃度逐漸減少(圖2B)。這與顆粒細胞中SIRT1 mRNA表達量規(guī)律性相同。培養(yǎng)液中白黎蘆醇和尼克酰胺濃度在25 μmol/L及以下時，處理組與空白對照組中雌激素分泌量沒有顯著差異;當濃度達到50 μmol/L及以上時，處理組中雌激素分泌量與空白對照組存在極顯著或顯著差異。

圖2 含不同濃度白黎蘆醇、尼克酰胺的DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞中雌激素分泌量Fig.2 Estrogen levels in porcine ovarian granulosa cells cultured in DMEM/F-12 with different concentrations of resveratrol and nicotinamide

2.3 豬卵巢顆粒細胞中SIRT1 mRNA表達量與其分泌雌激素的相關性

統(tǒng)計分析結果表明，豬卵巢顆粒細胞中SIRT1 mRNA表達量與雌激素分泌量存在正相關，相關系數(shù)為0.966 8(圖 3)。

圖3 豬卵巢顆粒細胞中雌激素含量與SIRT1 mRAN相對表達量間的關系Fig.3 Correlation between estrogen level and SIRT1 mRAN expression level in porcine ovarian granulosa cells

3 討論

SIRT1是一種二氫尿嘧啶脫氫酶依賴的具有去乙?；富钚缘亩喙δ苻D錄調(diào)節(jié)因子，通過組蛋白/非組蛋白去乙酰化，廣泛參與調(diào)控哺乳動物脂肪代謝、糖代謝、胰島素分泌等多條信號代謝通路，調(diào)節(jié)基因轉錄、能量代謝及細胞衰老［9-12］。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，人和小鼠的SIRT1基因與卵巢中孕酮、雌激素分泌存在密切相關性［13］。雌性小鼠雙側卵巢切除模型研究發(fā)現(xiàn)，多種組織中SIRTl蛋白表達量均明顯減少，在卵巢、心臟、主動脈和骨骼肌中減少的尤為明顯;同時發(fā)現(xiàn)，SIRT1敲除的雌性小鼠卵巢顆粒細胞分泌雌激素水平顯著降低［14］，但豬SIRT1基因對生殖激素分泌的影響研究尚未見報道。

本研究首次報道了豬卵巢顆粒細胞中SIRT1基因量的變化對顆粒細胞分泌雌激素的影響。qRTPCR結果表明，隨著白黎蘆醇濃度升高，SIRT1 mRNA表達量逐漸上升，白黎蘆醇濃度達到50 μmol/L時，SIRT1 mRNA表達量最高，但隨后由于白黎蘆醇濃度的增大，顆粒細胞出現(xiàn)凋亡，SIRT1 mRNA表達量開始下降;相反，隨著尼克酰胺濃度升高，SIRT1 mRNA表達量逐漸降低。上述結果說明白黎蘆醇可有效促進豬卵巢顆粒細胞中SIRT1 mRNA的表達，而尼克酰胺則抑制SIRT1 mRNA表達。分析不同處理的顆粒細胞培養(yǎng)液中雌激素變化規(guī)律，結果發(fā)現(xiàn)雌激素變化規(guī)律與顆粒細胞中SIRT1 mRNA表達規(guī)律一致。兩者相關分析表明，SIRT1 mRNA表達量與雌激素分泌量存在較強的正相關。該結果初步說明豬卵巢顆粒細胞中SIRT1 mRNA表達量影響顆粒細胞分泌雌激素的能力，具體調(diào)控機制需進一步研究。

［1］HOWITZ K T，BITTERMAN K J，COHEN H Y，et al.Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan［J］.Nature，2003，425:191-196.

［2］HO C，VAN DER VEER E，AKAWI O，et al.SIRT1 markedly extends replicative lifespan if the NAD+salvage pathway is enhanced［J］.FEBS Lett，2009，583(18):3081-3085.

［3］VAZIRI H，DESSAIN S K，NG EATON E，et al.hSIR2(SIRT1)functions as an NAD2 dependent p53 deacetylase［J］.Cell，2001，107(2):149-159.

［4］JOHNSON A L，LANGER J S，BRIDGHAM J T.Sirtuins as a cell cycle-related and antiapoptotic protein in granulosa cells［J］.Endocrinology，2004，143:3405-3413.

［5］KONG X X，WANG R，LIU X J，et al.Function of SIRT1 in physiology［J］.Biochemistry(Mosc)，2009，74(7):703-708.

［6］YAO Y，LI H，GU Y，et al.Inhibition of SIRT1 deacetylase suppresses estrogen receptor signaling［J］.Carcinogenesis，2010，31:382-387.

［7］ELANGOVAN S，RAMACHANDRAN S，VENKATESAN N，et al.SIRT1 is essential for oncogenic signaling by estrogen/estrogen receptor alpha in breast cancer［J］.Cancer Res，2011，71:6654-6664.

［8］李碧俠，趙 芳，任守文，等.豬SIRT1基因熒光定量PCR檢測方法的建立［J］.華北農(nóng)學報，2011，26(增刊):44-46.

［9］LEE J H，SONG M Y，SONG E K，et a1.Overexpression of SIRT1 protects pancreatic beta-cells against cytokine toxicity by suppressing the nuclear factor-kappa signaling pathway［J］.Diabetes，2009，58:344-351.

［10］李莉萍，曾衛(wèi)民，郭明日.SIRT1的生物學功能及其在胰島素抵抗中的作用［J］.生命科學研究，2010，14(4):372-375.

［11］TAKAYAMA K，ISHIDA K，MATSUSHITA T，et al.SIRT1 regulation of apoptosis of human chondrocytes［J］.Arthritis Rheum，2009，60(9):2731-2740.

［12］LI H，RAJENDRAN G K，LIU N，et al.SirT1 modulates the estrogen-insulin-like growth factor-1 signaling for postnatal development of mammary gland in mice［J］.Breast Cancer Res，2007，9:1-8.

［13］KOLTHUR-SEETHARAM U，TEERDS K，DE ROOIJ D G，et al.The histone deacetylase SIRT1 controls male fertility in mice through regulation of hypothalamic-pituitary gonadotropin signaling［J］.Biol Reprod，2009，80:384-391.

［14］PANG W J，YANG Y J，YANG G S，et al.Modulation of Sirt1 by resveratrol and nicotinamide alters proliferation and differentiation of pig preadipocytes［J］.Mol Cell Biochem，2008，307(1-2):129-140.