馬金友， 余 燕， 吳世秀， 張金洲， 趙恒章， 徐之勇

(1.河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學(xué)院動物病毒研究所，河南 新鄉(xiāng) 453003)

2006年以來高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的流行使養(yǎng)豬業(yè)遭受了重大損失，因此，通過“以防為主”，提高豬自身免疫能力以增強其抗病力，是解決豬病及抗生素等藥物濫用問題的一條非常有效的途徑。目前，對于PRRSV免疫預(yù)防研究工作已經(jīng)取得了一些進展［1－2］，但對病毒入侵宿主細胞后，一些相關(guān)免疫因子對病毒感染過程中的囊泡運輸系統(tǒng)是如何調(diào)控的還知之甚少，尤其在病毒的復(fù)制或參與病毒防御等方面。

二磷酸腺苷－核糖基化因子(ADP－ribosylation factors，ARFs)屬于小G蛋白質(zhì)Ras家族，最初命名是根據(jù)它能作為霍亂毒素催化GS蛋白質(zhì)ADP核糖基化反應(yīng)的輔助因子，在N端第二位(通常為氨基酸G)發(fā)生肉豆蔻?；?］。研究發(fā)現(xiàn)ARFs在細胞囊泡運輸、磷脂代謝、細胞骨架重組及調(diào)節(jié)細胞吞噬等方面起重要作用［4－5］，近期報道哺乳動物的一些ARF 成員與病毒的感染有關(guān)［6－7］。ARF6 作為 ARFs的重要成員之一，其功能由ARF6的效應(yīng)子GTP酶激活蛋白質(zhì)GAPs和鳥苷交換因子GEFs相互協(xié)調(diào)來實現(xiàn)［8－9］。

ARF6效應(yīng)子可以特異性地通過PH結(jié)構(gòu)域與3，4，5－三磷酸磷脂酰肌醇［Phosphatidylinositol 3，4，5－trisphosphate，PtdIns(3，4，5)P(3)］相結(jié)合，使其蛋白質(zhì)向細胞膜上遷移，通過 Ras－Raf－MEK－ERK1/2途徑調(diào)控細胞功能，從而參與到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中［9－10］，ARF6 通過它的 GAP－Centaurin－α1 行使調(diào)控功能［11］，間接地參與到病毒感染和抗病毒過程中［12］，同時，也是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo) PI3－K 途徑下游的重要成員［10，13］，因此 ARF6 效應(yīng)子可能與豬抗病毒免疫密切相關(guān)。為了了解ARF6在PRRSV感染中的免疫防御作用和調(diào)節(jié)機制，本試驗擬通過豬arf6基因的克隆與分析，構(gòu)建該基因的原核表達載體以獲得抗血清，為進一步研究豬ARF6在PRRSV感染過程中的調(diào)控作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶BamH I與EcoRⅠ(TaKaRa公司生產(chǎn))、反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV(TaKaRa公司生產(chǎn))、Ex Taq DNA 聚合酶(TaKaRa公司生產(chǎn))、PMD18－T 載體(TaKaRa公司生產(chǎn))、T4 Ligase(TaKaRa公司生產(chǎn))、DL2000 marker(TaKaRa公司生產(chǎn))、6 mer隨機引物(TaKaRa公司生產(chǎn))、質(zhì)粒提取試劑盒(Omega公司生產(chǎn))、DNA回收試劑盒(Omega公司生產(chǎn))、親和層析純化柱及相關(guān)試劑(Novagen公司生產(chǎn))、100 bp Marker(Tiangen公司生產(chǎn))等均購于鄭州久是生物有限責(zé)任公司;瓊脂糖、蛋白胨和酵母浸出膏等均購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司;槍頭和離心管(Axygen公司生產(chǎn))購于北京鼎國工程公司;其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。PGEX－4T－2載體和大腸桿菌(Escherichia coli Top10、BL21)由河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)平臺實驗室保藏。

從河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院取疑似PRRSV感染的杜洛克豬肺、腦、心臟等組織，液氮凍存帶回實驗室處理。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI(National center for biotechnology information)對豬arf6(FJ455238)序列設(shè)計擴增arf6全長ORF引物［SArf6F(上游引物):5'－GCGATGGGGAAGGTGCTATC－3'和 SArf6R(下游引物):5'－GCTCATTAGGATTTGTAGTTAGAGG－3'］和原核表達引物［SArf6F1(上 游 引 物):5'－CC GGATCCATGGGGAAGGTGCTATC－3'和 SArf6R1(下 游 引 物):5'－GC GAATTCTCATTAGGATTTGTAGTTAGAGG－3'， 下劃線為酶切位點］。引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。根據(jù)豬actin(XM_003124280)序列設(shè)計組織分布的半定量PCR引物［SactinF(上游 引 物):5'－AAGGACCTCTACGCCAACACG－3' 和SactinR(下游引物):5'－GTCGTACTCCTGCTTGCTGATCC－3'］。

1.3 方法

1.3.1 豬arf6基因擴增

1.3.1.1 總RNA提取 取適當(dāng)組織(100 mg以下)于研缽(180℃烘烤3 h)中加入液氮充分研磨，然后加入1.0 ml Trizol(Invitrogen)混勻，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，室溫放置10 min;12 000 g，4℃離心10 min;上清液轉(zhuǎn)移至離心管，每1.0 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，劇烈搖動15 s左右，室溫放置8 min左右;12 000 g，4℃離心15 min;上層水相轉(zhuǎn)移至離心管中，加入0.5 ml異丙醇混勻，室溫放置8 min;12 000 g，4℃離心8 min;棄上清液，1.0 ml 75%乙醇洗 1 min，7 500 g，4 ℃離心5 min，重復(fù)洗1 次;棄上清液，空氣干燥3 min，加入60.00 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解沉淀。

1.3.1.2 cDNA合成 總體系為20.00 μl。配制1.00 μl 6 mer隨機引物 (100 ng/μl)，4.00 μg 總RNA，1.00 μl 10 mmol/L dNTP 混合物，用 DEPC 水補充至14.00 μl;PCR儀中65℃加熱5 min，然后冰浴至少1 min;輕微離心一下，然后加入以下成分:4.00 μl 5 × First－strand buffer，1.00 μl Rnase inhibitor，1.00 μl反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV;PCR儀中25℃溫浴5 min，42℃溫浴60 min，70 ℃加熱15 min，4 ℃后保存于冰箱中備用。

1.3.1.3 arf6基因擴增 PCR反應(yīng)管中分別加入以下成分:10 × Ex Taq buffer 2.50 μl，2.5 mmol/L dNTP 混合物2.00 μl，上、下游引物各1.00 μl，10 倍稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.00 μl，Ex Taq DNA Polymerase 0.25 μl，補充滅菌三蒸水至 25.00 μl。PCR 反應(yīng)程序如下:95 ℃，3 min;95 ℃ 35 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán);72℃再延伸5 min，4℃終止。

1.3.2 基因擴增產(chǎn)物的回收、連接和測序 檢測擴增的目的片段，根據(jù)DNA回收試劑盒說明回收目的片段;0.5 ml離心管中依次加入:載體(PMD18－T)0.40 μl，目的片段 6.00 μl，10 × Ligation buffer 1.00 μl，T4 Ligase 0.60 μl，滅菌三蒸水補充至 10.00 μl，16℃連接6 h;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10細菌和轉(zhuǎn)化細菌的檢測及測序，正確測序產(chǎn)物質(zhì)粒的提取、保存。

1.3.3 豬arf6組織分布 提取豬下丘腦、胸腺、肺、肺部淋巴結(jié)、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肌肉、十二指腸、空腸、回腸等組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以actin為內(nèi)標半定量PCR檢測arf6的組織分布。

1.3.4 序列分析 根據(jù)Blast程序 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)分析核酸序列，Signal P 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域及信號肽。

1.3.5 豬ARF6融合蛋白質(zhì)原核表達載體構(gòu)建與表達

1.3.5.1 arf6基因表達序列的擴增 擴增引物為SArf6F1和 SArf6R1，模板為含 arf6序列的質(zhì)粒PMD18－T－arf6，其它成分和程序參照方法 1.3.1.3的成分和步驟。

1.3.5.2 擴增的arf6序列和表達載體的酶切及回收1.5 ml Eppendorf管中分別依次加入:內(nèi)切酶緩沖液 5.00 μl;DNA 片段和 PET－4T－2 分別為 43.00 μl;BamHⅠ1.00 μl，EcoRⅠ1.00 μl，37 ℃酶切2.5 h。酶切后的片段回收按照DNA回收試劑盒說明進行。

1.3.5.3 表達載體和目的片段連接、轉(zhuǎn)化及檢測0.5 ml離心管中依次加入:酶切載體(PGEX－4T－2)1.50 μl，待連接的酶切 arf6 片段 6.50 μl，10 × Ligation buffer 1.00 μl，T4 Ligase 1.00 μl，總體積 10.00 μl，16℃連接6 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10細菌，轉(zhuǎn)化細菌的菌落檢測和質(zhì)粒雙酶切檢測驗證，符合要求的菌落測序，正確測序產(chǎn)物質(zhì)粒的提取、保存。

1.3.5.4 豬ARF6－GST重組融合蛋白質(zhì)的表達轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒于BL21細菌，挑選單菌落于2.0 ml LB(含100 IU/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基37℃搖培8 h;加入異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.2 mmol/L，37℃繼續(xù)搖培3 h;取菌液1.0 ml，離心去上清液，加入2×SDS－PAGE上樣緩沖液 50.00 μl，混勻;沸水浴 5 min，10 000 g 離心 1 min;取 8.00 μl進行 SDS－PAGE，檢測重組融合蛋白質(zhì)的表達;表達的融合蛋白質(zhì)進行可溶性分析。

1.3.5.5 豬ARF6－GST重組融合表達蛋白質(zhì)的純化 挑選檢測表達的菌落接種于5.0 ml LB(含100 IU/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基37℃搖培過夜;1∶100接種于200.0 ml LB(含100 IU/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基37℃搖培3 h，加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L，18℃繼續(xù)搖培16 h;收取菌液4℃，6 000 g離心10 min;去上清液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.36)15.0 ml，懸浮細菌;冰浴中超聲破碎，4℃，12 000 g離心20 min;上清液轉(zhuǎn)移至新管中，加入1.0 ml GST純化介質(zhì)，4℃混勻3 h;上柱，收集流過液，PBS緩沖液洗柱，至流過液OD280接近于零;4.0 ml谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液，SDS－PAGE鑒定純化的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 豬arf6基因的克隆及結(jié)構(gòu)特征

通過豬肺臟和腦組織總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和基因擴增，得到了與目的基因片段大小一致的條帶(圖1)，測序比對后確認為豬arf6基因，大小為530 bp左右。

圖1 豬arf6基因RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of arf6 gene from swine

豬arf6基因包含一個長度為528 bp開放閱讀框，預(yù)測編碼175個氨基酸，理論分子質(zhì)量約為20 080，pI為8.97。通過其序列的保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，豬ARF6蛋白質(zhì)含有典型的p loop、Switch區(qū)、Interswitch區(qū)和N端疏水區(qū)的Hasp，同時，在N端第二位含有可被肉豆蔻?；母拾彼?。這些結(jié)構(gòu)特征反應(yīng)了豬ARF6在進化上是高度保守的。信號肽預(yù)測該蛋白質(zhì)序列沒有信號肽序列。

2.2 豬arf6的組織分布

分別以豬下丘腦、胸腺、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肺、肺部淋巴結(jié)、十二指腸、肌肉、空腸、回腸cDNA為模版，以actin基因為內(nèi)標，進行arf6基因PCR檢測。結(jié)果(圖2)顯示，12種組織中均可以檢測到arf6基因的轉(zhuǎn)錄表達，說明該基因的表達沒有組織特異性。

圖2 豬arf6基因的組織分布Fig.2 Tissue transcriptional profile of arf6 gene from swine

2.3 豬ARF6融合蛋白質(zhì)原核表達載體構(gòu)建、表達與純化

由于ARF6是細胞中囊泡運輸?shù)闹匾蛋白質(zhì)，可通過它的效應(yīng)子—Centaurin－α1對病毒的入侵起著重要的調(diào)控作用，為了進一步研究ARF6的功能及構(gòu)建ARF6原核表達載體進行融合蛋白質(zhì)表達以獲得抗血清。本試驗設(shè)計原核表達引物通過PCR從質(zhì)粒PMD18－T－arf6中克隆表達序列，雙酶切后連接到PGEX－4T－2載體上，菌落PCR獲得了和目的片段大小一致的條帶，挑選菌落培養(yǎng)后提取的質(zhì)粒雙酶切圖譜(圖3)進一步證實構(gòu)建融合蛋白質(zhì)表達載體的正確性。根據(jù)克隆的arf6基因，我們成功構(gòu)建了豬ARF6原核表達載體用于融合蛋白質(zhì)ARF6－GST的表達。挑選構(gòu)建好的表達載體PGEX－4T－arf6轉(zhuǎn)化的細菌，通過一系列的誘導(dǎo)表達獲得可溶性的融合蛋白質(zhì)，并經(jīng)過親和層析柱純化獲得了ARF6－GST融合蛋白質(zhì)(圖4)。該融合蛋白質(zhì)經(jīng)濃度測定可作為制備抗血清的抗原。

圖3 ARF6-GST融合蛋白質(zhì)表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant fusion protein plasmid ARF6-GST

圖4 ARF6-GST融合蛋白質(zhì)的可溶性分析與純化Fig.4 Solubility analysis and purification of the expressed fusion protein ARF6-GST

3 討論

ARFs是一類高度保守的GTP激酶，是分泌性囊泡形成的主要因子，同時在細胞器的形成、生物合成、胚胎發(fā)育、調(diào)節(jié)細胞吞噬及物質(zhì)運輸中起重要的調(diào)控作用，尤其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的囊泡運輸過程是必不可少的［4－5］。哺乳動物的一些ARF成員被病毒挾持參與了病毒裝配、復(fù)制和釋放［6－7］。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)具有導(dǎo)致懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等嚴重病癥特征，尤其2006年后該病的暴發(fā)使養(yǎng)豬業(yè)遭受了重大損失。研究中發(fā)現(xiàn)PRRSV感染早期豬arfs基因表達明顯上調(diào)。另外，我們克隆了豬arf6開放閱讀框序列并構(gòu)建了他們的原核表達載體，發(fā)現(xiàn)該ARF6具有其他動物的保守結(jié)構(gòu)域且序列結(jié)構(gòu)也很保守，說明這些小的GTP激酶在細胞內(nèi)部執(zhí)行著非常重要的功能。雖然ARF6在一些哺乳動物的病毒感染中扮演著不同的角色，但豬ARF6與病毒的關(guān)系目前還沒有具體的研究，但是我們?nèi)允强梢灶A(yù)見ARF6可能與豬的相關(guān)病毒入侵有著密切的相關(guān)性。

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