趙麗華

(西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615000)

石榴(Punica granatum L.)為石榴科(Punicaceae)石榴屬(Punica)落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)伊朗、阿富汗、印度等中亞一帶［1］，石榴屬有3個種:P.granatum、P.nana 及 P.protopunica，(2n=2x=16，18)，因為P.granatum具有經(jīng)濟、觀賞及藥用價值而被廣泛栽培［2-3］。從西漢張騫將石榴引入中國，至今已有2000多年的栽培歷史，經(jīng)長期天然雜交、基因突變、嫁接等，在中國產(chǎn)生了復(fù)雜多樣的品種和類型。據(jù)不完全統(tǒng)計，中國現(xiàn)有石榴品種資源230多個，形成了山東、新疆、陜西、安徽、河南、云南和四川7個主栽培區(qū)［4］。由于石榴是小雜果，國內(nèi)外對其研究的總體水平較落后，基因組信息非常有限，進而影響了石榴的生產(chǎn)以及國內(nèi)、國際間的交流。近年來國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用 RAPD［5-6］、SRAP［7］、SSR［8］、ISSR［9-10］、AFLP［11］等分子標記對石榴進行了遺傳分析，為石榴種質(zhì)資源研究提供分子依據(jù)。目前鮮于利用RAMP(Random am-plified microsatellite polymorphism)標記對石榴進行遺傳研究的報道，RAMP是利用ISSR引物和RAPD引物組合對基因組進行隨機擴增，其適合遺傳背景尚不清楚的物種的遺傳分析［12］。本研究旨在利用RAMP對中國石榴居群進行遺傳分析，為石榴資源進行有效保護及可持續(xù)利用提供遺傳信息。

1 材料與方法

1.1 材料

供試46個石榴品種(表1)采自云南蒙自縣石榴研究所、四川會理縣農(nóng)業(yè)局石榴品種資源圃。每個品種從3～5株健壯、無病蟲害石榴樹采30～50片嫩葉，冰壺運回實驗室，于－80℃冰箱保存。

表1 供試46個石榴品種產(chǎn)地、編號、名稱及特性Table 1 Origin，code，cultivar and main characteristics of 46 pomeg ranate cultivars

1.2 DNA 提取

參見趙麗華等［13］改良CTAB法從石榴幼葉中提取基因組DNA，0.80%瓊脂糖凝膠電泳及核酸蛋白質(zhì)分析儀測定DNA產(chǎn)量及質(zhì)量，然后將其稀釋為50 ng/μl工作液，放入4℃冰箱里備用。

1.3 引物篩選及PCR擴增

引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，由5條ISSR引物和20條RAPD引物組成100對引物，用3個形態(tài)差異較大的石榴品種從100對引物中篩選出DNA條帶清晰、多態(tài)性較高的引物對(表2)，用選出的多態(tài)性引物對對46個石榴品種基因組DNA進行PCR擴增;用梯度PCR儀(Eppendorf)確定每對引物的最適退火溫度。用2.00%瓊脂糖凝膠電泳(含0.1‰GV)分離PCR擴增產(chǎn)物，電壓為2 V/cm，電泳1.5～2.0 h，用紫外與可見分析裝置觀察并拍照記錄。

參照沈潔等［12］PCR 反應(yīng)體系，優(yōu)化 25 μl的PCR反應(yīng)體系為:Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、Taq DNA 聚合酶1 U、模板DNA 25 ng、引物各0.15 mmol/L、1×PCR buffer。擴增程序為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性45 s，退火(溫度見表2)1 min，72℃延伸2 min，45個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。

表2 RAMP引物序列、退火溫度和擴增結(jié)果Table 2 List of RAMP primers，annealing temperatures and amplification results

1.4 數(shù)據(jù)處理

將RAMP引物擴增產(chǎn)物進行DNA帶多態(tài)性位點統(tǒng)計，在相同遷移位置上有帶記錄為“1”，無帶記錄為“0”，亮度相差2倍的記錄為不同的條帶，建立由“0、1”組成的二元數(shù)據(jù)矩陣。采用 PopGen-1.32軟件計算多態(tài)位點百分率(P)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s氏基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon 多樣性指數(shù)(I)、Nei’s遺傳距離(Dg)、Nei’s遺傳相似系數(shù)(Sg)、遺傳分化系數(shù)(Gst)、基因流(Nm)。

2 結(jié)果

2.1 RAMP 多態(tài)性

14對RAMP引物對46個石榴品種進行PCR擴增，共擴出127條DNA條帶，平均每條引物擴增出8.57條DNA條帶，其中113條顯示多態(tài)性，平均每條引物擴增出7.53條多態(tài)性條帶，多態(tài)位點百分率(P)為88.98%(表2)。14對RAMP引物擴增的DNA條帶數(shù)為5～15條，多態(tài)位點百分率為71.43%～100.00%(表2);其中引物對5'-GTACACACAC-3'+5'-GGTCTACACC-3'擴增出的DNA譜帶數(shù)最多，為15條，多態(tài)位點百分率為80.00%，引物對5'-GTACACACAC-3'+5'-GGGGTGACGA-3'、5'-GTACACACAC-3'+5'-GGACACCACT-3'、5'-GCACACACAC-3'+5'-AAGACCGGGA-3'、5'-GCTCACTCTCTC-3'+ 5'-GACAGTCCCT-3'和5'-GTTCTCTCTC-3'+5'-TGTGGACTGG-3'擴增DNA譜帶多態(tài)性比率均為100.00%。

2.2 居群遺傳多樣性

用PopGen-1.32軟件對7個石榴居群DNA譜帶進行分析，結(jié)果(表3)顯示:7個居群多態(tài)位點百分率(P)分布范圍為32.28% ～65.63%，其中山東居群多態(tài)位點百分率最大，為65.63%，其對應(yīng)的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)也最大，分別為:1.653 5、1.314 3、0.191 2、0.296 6，表明該居群遺傳多樣性最為豐富;陜西、云南、河南、安徽、四川、新疆多態(tài)位點百分率由大到小依次為:64.57%、62.30%、60.63%、57.48%、36.22%、32.28%，表明各居群遺傳多樣性依次為:山東居群＞陜西居群＞云南居群＞河南居群＞安徽居群＞四川居群＞新疆居群。

表3 居群間遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of pomegranate populations

2.3 居群間的遺傳距離及遺傳分化

用PopGen-1.32對7個石榴居群DNA譜帶進行分析，得出各居群間的Nei’s遺傳相似系數(shù)(Sg)和遺傳距離(Dg)(表4)顯示，各居群間的Nei’s遺傳相似系數(shù)很高，變化范圍為0.912 0～0.980 6，各居群間的遺傳距離很近，變化范圍為0.019 6～0.092 1。其中山東居群與四川居群的親緣關(guān)系最遠，遺傳距離為0.092 1，遺傳相似系數(shù)為0.912 0;云南居群與陜西居群親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)為0.980 6，遺傳距離為0.019 6。

表4 7個石榴居群間的遺傳距離及遺傳相似系數(shù)Table 4 Coefficient of genetic similarity and genetic distance among seven pomegranate populations

7個石榴居群總基因多樣性系數(shù)(Ht)為0.188 7，居群內(nèi)多樣性系數(shù)(Hs)為0.154 1，遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.183 0，表明分布在居群間的遺傳變異占總遺傳變異的18.30%，居群間遺傳分化較弱;居群間基因流的估測值(Nm)為2.231 5，Nm＞2，表明居群間存在較強的基因流。

3 討論

居群是生活在一定時間與空間上的所有同種個體的總和，是進化的基本單位。本研究結(jié)果表明，石榴在中國7個主產(chǎn)區(qū)居群的遺傳多樣性依次為:山東居群﹥陜西居群﹥云南居群﹥河南居群﹥安徽居群﹥四川居群﹥新疆居群。山東居群遺傳多樣性最豐富，其地理位置臨近陜西，從陜西引種后，石榴可能對山東生態(tài)環(huán)境因子各異的驅(qū)動力及人為選擇壓力等因素產(chǎn)生應(yīng)答，在較短的時間尺度內(nèi)促進生物物種的多樣化進程［14-15］，因而具有豐富的遺傳多樣性。石榴在陜西的栽培歷史最為悠久，發(fā)生突變、選擇等時間也較長，其遺傳多樣性位于其次。由于基因流更容易從遺傳多樣性較高的居群進入遺傳多樣性較低的居群［16-17］，因此，山東和陜西可能是中國石榴傳播中心。

在基因流相關(guān)的適應(yīng)性進化和多樣化進程中，新的或變化的生態(tài)環(huán)境因子為不同的遺傳來源提供了新的選擇壓力和適應(yīng)性進化機會，一旦種內(nèi)、種間的基因流積極應(yīng)答復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境因子及生態(tài)各異的選擇壓力與驅(qū)動力，在較短的時間尺度內(nèi)也會促進生物物種的適應(yīng)性進化和多樣化進程［15］。本研究中7個居群石榴間的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.183 0，表明分布在居群間的遺傳變異占總遺傳變異的18.30%，居群內(nèi)遺傳變異占總變異的81.70%，可能是中國石榴的7個主栽培區(qū)自然環(huán)境多樣化，為居群內(nèi)變異提供了有利條件，因而遺傳變異主要存在與居群內(nèi)。生物界普遍認為居群間基因流(Nm)＞1的基因流就足以抵制居群由遺傳漂變引起的遺傳結(jié)果，維持遺傳變異的多樣性［14，17］，本試驗7個石榴居群間基因流的估測值(Nm)為2.231 5，表明居群間存在較強的基因流。石榴為異花授粉，從栽培石榴的7個主產(chǎn)區(qū)地理位置看，花粉傳播形成基因流的可能性很低，應(yīng)主要為人工引種完成遺傳物質(zhì)的遷移，形成基因流，而過強的基因流可能會導(dǎo)致當(dāng)?shù)鼗蛐偷耐|(zhì)化或更換，并破壞當(dāng)?shù)匚锓N的適應(yīng)性［18-20］，因此，各地在進行引種石榴豐富當(dāng)?shù)剡z傳多樣性時，同時要注意地方品種資源的保護。

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