陳仁金，王珍珍，楊章平，毛永江，冀德君，朱孝榮

（1.徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，江蘇 徐州 212004；2.徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究中心，江蘇 徐州 212004；3.揚州大學(xué)動科學(xué)院，江蘇 揚州 22500）

乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，在世界范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟損失，研究者嘗試許多方法用于控制這種復(fù)雜的疾病，包括改進(jìn)牧場的管理、對干奶牛進(jìn)行抗生素治療、注射疫苗和監(jiān)控臨床乳房炎等。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，用生物技術(shù)手段來預(yù)防和控制乳房炎成為熱點之一。

IL－8自發(fā)現(xiàn)以來，成為在趨化性細(xì)胞因子中是一個比較活躍的研究領(lǐng)域，各種非特異性炎癥的病理發(fā)生過程中頻繁地有IL－8的參與，以及IL8基因易于受到外界的刺激而被激活，因此IL－8可能在炎癥、免疫反應(yīng)和機體防御反應(yīng)中具有廣泛的作用。對于IL－8在人類上研究較多［1－3］，而與奶牛疾病方面的研究最近幾年越來越受關(guān)注。IL－8易于受到外界的刺激而被激活，已研究證明IL－8蛋白和mRNA的表達(dá)與奶牛乳房炎有密切的聯(lián)系［4］。當(dāng)牛乳房受感染后，IL－8能誘導(dǎo)宿主防御系統(tǒng)抵抗病菌的侵入，同時IL－8會大量聚集。IL8基因的表達(dá)量也顯著增加［5－7］。研究發(fā)現(xiàn)IL8基因－233（G＞A）和2789（A＞G）＆2862（T＞C）位點對SCS顯著相關(guān)；了探索該位點不同基因型個體在血液中的表達(dá)差異，對該位點形成的不同基因型個體熒光定量PCR分析。對IL8基因的抗病機理進(jìn)行初步探索，為奶?？谷榉垦仔誀詈蜻x基因的研究積累基礎(chǔ)分子數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取揚大牧場健康的中國荷斯坦牛30頭。胎次在2～3胎，處于泌乳中期。保證IL8基因各個基因型10頭。尾靜脈采血，ACD抗凝劑，新鮮血樣提取RNA，提取的RNA－70℃保存。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)用于熒光定量的目的基因IL8基因的mRNA序列（GenBank：NM＿173925）設(shè)計引物，內(nèi)參基因β－actin引物根據(jù) mRNA序列（GenBank：AY141970）設(shè)計。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 RT－PCR

反應(yīng)過程參照TaKaRa RNA AL PCRTMKit（AMV）反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明，按步驟進(jìn)行。將血液中總RNA作為模板在滅菌的0.2mL PCR離心管中依次加入以下組分的樣品。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL（反應(yīng)液在冰上配制）：在0.2mL的PCR管中加入1μg的總RNA，Oligo dT Primer 1μL，5×PrimeScriptTMBuffer 4μL，Random primers 1μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 1μL，加 RNase Free dH2O至總體積為20μL。將加好試劑的PCR管瞬時離心后放在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄條件如下：37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）85℃5sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）所得產(chǎn)物即為cDNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實時熒光定量PCR

采用SYBR GreenⅠ染料法進(jìn)行熒光定量，熒光定量PCR體系為20μL：

以上步驟均為冰上操作，每個樣本設(shè)三個重復(fù)。

熒光定量PCR擴增程序：95℃預(yù)變性1min；95℃變性30s，60℃退火15s，72℃延伸34s（data collection），40個循環(huán)；為分析擴增產(chǎn)物的特異性，PCR擴增結(jié)束后采集多個信息點進(jìn)行溶解曲線分析，程序為：95℃ 15s，60 ℃ 1min；95 ℃ 15s，60℃15s。

1.5 統(tǒng)計軟件與方法

Primer Premier 5.0，SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件熒光定量計算采用2－△△CT方法［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取

RNA提取結(jié)果見圖1總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢出3條亮帶，從上到下分別為28s，18s和5s，說明提取的RNA完整性良好，無明顯降解，其OD260／OD280在1.8左右，純度較高，可用于后續(xù)的實驗。

2 結(jié)果與分析

2.2 IL8基因突變位點3種基因的相對定量表達(dá)分析

IL8基因－233（G＞A）位點的突變產(chǎn)生3種基因型。AA、AG和GG 3種基因型在血液中的熒光定量的△CT見表2，GG基因型的△CT極顯著低于AA和AG基因型（P＜0.01）。GG基因型的相對表達(dá)量極顯著高于AA和AG基因型（P＜0.05）（圖2）。

圖2 IL8基因－233（G＞A）位點不同基因型的表達(dá)量

表2 IL8基因－233（G＞A）位點不同基因型個體的△CT和RQ值

3 討論

IL8是一種重要的趨化因子，具有刺激中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞發(fā)生趨化游走，介導(dǎo)細(xì)胞在炎癥部位聚集、活化以及修復(fù)損傷的組織等功能［9］。然而，這些作用必須通過其與相應(yīng)受體（interleukin－8receptor，IL8R，即CXCR）結(jié)合并借助信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來實現(xiàn)［10］。在大腸桿菌感染引起的乳房炎的奶中，IL－8含量顯著增加［11，12］。在金黃色葡萄球菌感染的奶牛乳房炎泌乳物中，能檢測到IL－8趨化活性，但在非乳房炎泌乳物中沒有此活性［13］。所以在乳房炎發(fā)生時，IL－8誘導(dǎo)激發(fā)中性粒細(xì)胞時起著重要的作用。

對于IL8基因的－233（G＞A）位點，GG基因型的表達(dá)量顯著高于其它兩種基因型（P＜0.05），所以GG基因型有較強的乳房炎抗性。233（G＞A）位點位于IL8基因的5′側(cè)翼區(qū)，該突變可能影響該基因表達(dá)調(diào)控，結(jié)果顯示，突變使該基因的表達(dá)量下降。對于其機理，需要進(jìn)一步進(jìn)行分析研究。

［1］ Pourfarzam S，Ghazanfari T，Yaraee R，et al.Serum levels of IL－8and IL－6in the long term pulmonary complications induced by sulfur mustard：Sardasht－Iran Cohort Study［J］.Int Immunopharmacol，2009，9：1482－1488.

［2］ Liyan Wang，Gencheng Han，Renxi Wang，et al.Regulation of IL－8production by complement－activated product，C5a，in vitro and in vivo during sepsis［J］.Clin Immunol，2010，137：157－165.

［3］ Weiss N，Deboux C，Chaverot N，et al.IL8and CXCL13are potent chemokines for the recruitment of human neural precursor cells across brain endothelial cells［J］.J Neuroimmunol，2010，223：131－134.

［4］ Lee J W，Bannerman D D，Paape M J，et al.Characterization of cytokine expression in milk somatic cells during intramammary infections with Escherichia coli or Staphylococcus aureus by real－time PCR［J］.Vet Res，2006，37（2）：219－229.

［5］ Watanabe A，Yagi Y，Shiono H，et al.Effects of intramammary infusions of interleukin－8on milk protein composition and induction of acute－phase protein in cows during mammary involution［J］.Can J Vet Res，2008，72（3）：291－296.

［6］ Bannerman D D，Kauf A C W，Paape M J，et al.Comparison of Holstein and Jersey Innate Immune Responses to Escherichia coli Intramammary Infection［J］.J.Dairy Sci，2008，91（6）：2225－2235.

［7］ Günther J，Liu S，Esch K，et al.Stimulated expression of TNF－a and IL－8，but not of lingual antimicrobial peptide reflects the concentration of pathogens contacting bovine mammary epithelial cells［J］.Vet Immunol Immunopathol，2010，135（1～2）：152－157.

［8］ Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2（－Delta Delta C（T））Method［J］.Methods，2001，25（4）：402－408.

［9］ Laudanna C，Campbell J J，Butcher E C.Role of Rho in chemoattractant－activated leukocyte adhesion through integrins［J］.Science，1996，271：981.

［10］ Taub D D，Oppenheim J J.Review of the chemokine meeting the third international symposium of chemotactic cytokines［J］.Cytokine，1993，5（3）：175－179.

［11］ Bannerman D D，Paape M J，Lee J－W，et al.Escherichia coli and StapH ylococcus aureus elicit differential innate immune responses following intramammary infection［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2004，11（3）：463－472.

［12］ Riollet C，Rainard P，Poutrel B.Differential induction of complement fragment C5aand inflammatory cytokines during intramammary infections with Escherichia coli and Staphylococcus aureus［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2000，7（2）：161－167.

［13］ Barber M R，Yang T J.Chemotactic activities in nonmastitic and mastitic mammary secretions：Presence of interleukin－8in mastitic but not nonmastitic secretions［J］.Clin Diagn Lab Immunol，1998，5（1）：82－86.