楚秋霞，陳付英，王志方，馮亞杰，徐照學＊，王荷香

（1.河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450008；2.河南農業(yè)職業(yè)學院，河南 鄭州 451090）

南陽牛BoLA－DRA基因編碼區(qū)生物信息學分析

楚秋霞1，陳付英1，王志方1，馮亞杰1，徐照學＊1，王荷香2

（1.河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450008；2.河南農業(yè)職業(yè)學院，河南 鄭州 451090）

［目的］預測南陽牛BoLA－DRA編碼蛋白區(qū)的理化性質和結構特征。［方法］運用生物信息學分析軟件。［結果］DRA基因與其它物種核苷酸序列的同源性均在90%以上。進化樹分析羊與牛在同一個分支上，親緣關系最近。BoLA－DRA編碼蛋白為疏水性蛋白，1個跨膜螺旋的膜蛋白，7個功能結構域，6個翻譯后修飾位點。預測N末端包含信號肽序列，其切割位點位于26～27位的氨基酸之間。亞細胞定位該蛋白定位在細胞膜上，由α螺旋結構，β折疊結構、β轉角結構和無規(guī)則卷曲結構形成二級結構。［結論］本試驗初步獲得了BoLA－DRA編碼蛋白區(qū)生物信息學分析數(shù)據(jù)。

牛；主要組織相容性復合物；DRA；生物信息學

主要組織相容性復合體（majorhistocompatibility complex，MHC），是由緊密連鎖的高度多態(tài)基因座所組成的染色體上的一個遺傳區(qū)域［1］。MHC的發(fā)現(xiàn)是在20世紀30年代進行小鼠皮膚移植試驗中發(fā)現(xiàn)的。MHC在對抗感染和對許多自身免疫性疾病的易感性方面有重要作用。1978年，Amorena首次報道了牛的MHCⅠ抗原并將牛的MHC命名為牛白細胞抗原（Bovine Lymphocyte Antigen，Bo－LA），位于牛的第23號染色體上［2］。牛的 MHC分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類；MHC的多態(tài)性集中在Ⅱ類區(qū)域的DR和DQ亞區(qū)的基因上，在其免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著主要的作用［3］。文獻報道，MHC基因與生物體的數(shù)量性狀具有相關性，例如，抗病性、生長率和脂肪酸沉積等，以至于研究人員對MHC進行大量的研究［4］。BoLA－DRA基因位于Ⅱ類區(qū)域的DR亞區(qū)的基因，DR基因座中包含 DRA、DRB1、DRB2、DRB3四個基因位點，其中DRB3是唯一高度表達的基因，具有高度的多態(tài)性，它編碼一個功能性限制因子；DRA基因可以表達，但多態(tài)性有限。目前，研究人員主要集中在DRB3基因的研究，對DRA基因的研究還不夠多。本研究采用生物信息學方法對BoLA－DRA基因及其編碼產物的理化性質、序列、蛋白質結構、進化樹構建以及生物學功能進行預測和分析，初步從分子水平上了解BoLA－DRA基因基本結構和生物學功能，為進一步研究牛BoLA－DRA基因與疾病的抗病機理提供一定的參考。

1 材料與方法

將已克隆的BoLA－DRA基因進行測序［5］。同源性分析采用http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／中BLAST軟件；進化樹構建采用MEGA5軟件；預測蛋白的理化性質采用ExPasyhttp：www.expasy.org／tools；信號肽預測采用http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／；預測亞細胞定位采用http：／／psort.nibb.ac.jp／form2.html；預測蛋白質結構域采用http：／／www.expasy.org／prosite／ 和http：／／smart.embl－h(huán)eidelberg.de／；預測二級結構采用DNASTRAR 6.0軟件；預測跨膜結構采用http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM－2.0／。

2 結果與分析

2.1 BoLA－DRA基因核苷酸序列分析

經測序分析，BoLA－DRA基因CDS區(qū)全長762 bp。由A、T、G、C四種堿基組成，分別為24.8%、23.5%、24.9%、26.8%。物種間進行 BLAST 比對，BoLA－DRA核苷酸序列與其他物種間一致性均在90%以上。以上數(shù)據(jù)顯示，該基因具有高度保守性。

2.2 BoLA－DRA基因編碼氨基酸序列分析

BoLA－DRA基因CDS區(qū)編碼253個氨基酸，該蛋白分子量為28.356kD，理論等電點為5.09。不穩(wěn)定指數(shù)和脂肪系數(shù)分別為47.74和24.8，親水性值為0.852，說明該蛋白是一個疏水蛋白。在該蛋白的20種氨基酸中，堿性氨基酸占30%，酸性氨基酸占49%。表明酸性氨基酸多于堿性氨基酸，該蛋白呈酸性，是一種酸性蛋白，與預測等電點pI＝5.09相符。

2.3 進化樹構建

應用BIOXM軟件進行序列比對，結果顯示，BoLA－DRA的氨基酸序列與羊的同源性最高為88%；與人、貓、馬、野豬、黑猩猩、兔的同源性分別為76%、77%、79%、75%、76%、75%。應 用 MEGA 5.0軟件NJ法得出了基于DRA基因氨基酸序列9個物種的系統(tǒng)進化樹（圖1）。分析可知BoLA－DRA基因與羊在同一個分支上，親緣關系最近。

2.4 BoLA－DRA翻譯后修飾

通過翻譯后修飾位點分析，理論推測該蛋白磷酸化位點有5個（Ser：1，Thr：2，Tyr：2），糖基化位點1個。蛋白質的磷酸化可以調節(jié)蛋白質的活性。磷酸化和糖基化是蛋白質翻譯后修飾與蛋白質的功能密切相關。

2.5 BoLA－DRA蛋白的跨膜結構預測

應用 TMHMM（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）對BoLA－DRA基因推導氨基酸序列進行跨膜結構預測。結果發(fā)現(xiàn)，BoLA－DRA蛋白是一種具有1個跨膜螺旋的膜蛋白，由胞外區(qū)（1～217位氨基酸）、跨膜區(qū)（218～240位氨基酸）和胞內區(qū)（241～253位氨基酸）3部分構成的跨膜蛋白，預示著BoLA－DRA蛋白在細胞內作為一種膜受體，胞外區(qū)識別外界信號，并通過信號轉導途徑，引起細胞內生理生化反應。

2.6 BoLA－DRA蛋白的結構域分析

所謂結構域是指蛋白質序列功能、結構和進化的單元，通常由50～300個氨基酸組成，有空間構象特異性。單條蛋白質序列可以包含一個或多個結構域。利用網上在線工具，分析BoLA－DRA蛋白的結構域，結果表明，此蛋白包含46～54，280～288，431～439 氨基酸區(qū)域的 2FE2S（2Fe－2Sferredoxintype iron－sulfur binding region）；299～314氨基酸區(qū)域的IGFBP （Insulin－like growth factor－binding protein）；376～411氨基酸區(qū)域的 ANAPHYLATOXIN（Anaphylatoxin domain）；452～507氨基酸區(qū)域的VWFC（VWFC domain）；第628～639氨基酸區(qū)域的EGF（Epidermal growth factor－like domain）特征功能結構域（圖2）。

圖2 牛BoLA－DRA蛋白結構域預測分析結果

2.7 BoLA－DRA蛋白的信號肽預測

預測蛋白質結構的同時，對其進行信號肽分析有助于蛋白質功能域的區(qū)分及蛋白質細胞定位。信號肽是指N端起始密碼子ATG之后的一組密碼子的產物，一般為20～30個氨基酸，其作用是引導蛋白質的分泌。采用SignalP4.0Server prediction軟件分析，預測該蛋白1～25個氨基酸是信號肽序列（圖3），即其是分泌性蛋白質?？梢员环置谥羶荣|網膜，促使蛋白進入細胞外，參與細胞因子作用。

圖3 南陽牛BoLA－DRA蛋白的信號肽預測結果

2.8 BoLA－DRA蛋白質亞細胞定位預測

利用亞細胞定位程序（http：／／psort.nibb.ac.jp／form2.html），預測BoLA－DRA蛋白的亞細胞定位情況，結果發(fā)現(xiàn)，該蛋白可能位于四個細胞器中，位于細胞膜的概率為60.9%，內質網概率為30.4%、空泡和高爾基體概率都為4.3%。與該蛋白質的疏水性和跨膜區(qū)分析的結果一致，BoLADRA為疏水性的蛋白質，是一種具有跨膜螺旋的膜蛋白。

2.9 BoLA－DRA蛋白質二級結構預測

利用DNASTRAR6.0軟件中的Protean程序和在線工具SWISS－MODEL對BoLA－DRA蛋白的二級結構進行了預測，二級結構運用了兩種算法，預測得到的α螺旋結構，β折疊結構、β轉角結構和無規(guī)則卷曲結構（圖4）。

圖4 牛BoLA－DRA蛋白的二級結構預測結果

3 討論

MHC分子幾乎在所有脊椎動物中都存在高度多態(tài)性和連鎖不平衡兩個顯著特點，對MHC遺傳變異分析可以提供物種的遺傳多樣性，因而具有重要的生物學意義。通過序列分析軟件對BoLA－DRA基因進行預測，CDS區(qū)序列的大小為762bp終止密碼子為 TGA。BoLA－DRA基因CDS區(qū)核苷酸序列與其他物種間一致性均在90%以上。氨基酸序列與羊、人、貓、馬、野豬、黑猩猩、兔7個物種同源性在75%～88%，說明該基因具有穩(wěn)定的保守區(qū)。進化樹分析顯示，牛和羊聚為一類，BoLADRA基因與羊的親緣關系最近。核苷酸序列相似性分析和分子進化樹結果相符合，這與動物學分類結果一致，這種同源性在一定程度上代表著物種親緣關系的遠近，同時也反映了BoLA－DRA編碼產物在不同物種的結構上的穩(wěn)定性對生物體的功能重要性。

決定蛋白質結構類型和穩(wěn)定性的一個最重要的因素是氨基酸序列的疏水性。通過預測親水性值為0.852，說明該蛋白是一個疏水蛋白，易形成跨膜結構。Kyte等的研究表明，通過氨基酸序列的疏水性可以預測膜蛋白的結構。通過對膜蛋白跨膜結構的預測能為該蛋白的功能研究提供重要線索。跨膜結構預測該基因具有1個跨膜螺旋的膜蛋白，這就為配體的特異性結合提供了受體的分子基礎，具體生物學功能有待進一步研究。結構域分析預測，該蛋白包含7個特征功能結構域，預測該蛋白具有免疫應答、脅迫應答、信號轉導、受體等功能，可能對牛免疫力和抗病性起關鍵作用。該基因由α螺旋結構，β折疊結構、β轉角結構和無規(guī)則卷曲結構構成二級結構，主要定位在細胞膜中，屬于分泌型蛋白。具有信號肽的分泌蛋白，往往作為重要的細胞因子在生物體的生長、發(fā)育以及細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。信號肽預測N段肽鏈第26－27bp為剪切位點，因此在剪切位點進行修飾可能會提高該基因的表達。本研究利用生物信息學分析軟件對Bo－LAZ－DRA基因和蛋白序列進行初步的預測，研究結果將為進一步研究BoLA－DRA基因與疾病性狀相互作用的機制提供參考。

［1］林 劍.免疫遺傳學［M］.北京：高等教育出版社，1997.

［2］Amorena B，Stone W H.Serologically defined （SD）locus in cattle［J］.Science，1978，201（4351）：159－161.

［3］金伯泉.細胞和分子免疫學［M］.3版.北京：科學出版社，2001.

［4］Renard C，Hart E，Sehra H，et al.The genomic sequence and analysis of the swine major histocompatibility complex［J］.Genomics，2006，88：96－110.

［5］楚秋霞，徐照學，施巧婷，等.南陽牛BoLA－DRA基因的克隆及其在大腸埃希菌中的表達［J］.動物醫(yī)學進展，2010，31（6）：5－10.

Bioinformatics Analysis on Coding Regions of BoLA－DRA Gene in Nanyang Cattle

CHU Qiu－xia1，CHEN FU－ying1，WANG Zhi－feng1，F(xiàn)ENG Ya－jie1，XU Zhao－xue＊1，WANG He－xiang2

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Henan Academy of Agriculture Science，Zhengzhou Henan 450008；2.Henan Vocational College of Agriculture，Zhengzhou Henan，451090）

【Objective】To predict the physicochemical properties and structural characteristics of BoLADRA protein of Nanyang cattle.【Method】The BoLA－DRA gene and its encoding products were analyzed using bioinformatics analysis softwares.【Results】The nucleotide sequence of cording region（CDS）of Bo－LA－DRA gene of Nanyang cattle shared over 90%homology with other species.Phylogenetic tree analysis showed that the cattle had the closest genetic relationship with sheep and they were in same branch.The BoLA－DRA encoding product was a hydrophobic protein，having one membrane protein with one transmembrane helix，seven functional domains，and six post－translational modification sites.Signal peptide sequence of N－terminal was predicted，and the cleavage site was located between 26and 27amino acid.Subcellular localization showed that this protein was located in cell membrane.The secondary structure of the protein was formed by the alpha helical structure，beta－folded structure，beta turn structure and random coil structure.【Conclude】The work had provided the useful bioinformatics date for the bovine BolA－DRA protein.

cattle；MHC；DRA；bioinformatics analysis

S823.2

A

1001－9111（2013）06－0028－04

2013－09－12

2013－10－25

國家肉牛產業(yè)技術體系項目（CARS－38）

楚秋霞（1984－），女，河南許昌人，助研，主要從事動物胚胎工程研究。

＊通訊作者：徐照學（1961－），男，陜西華縣人，研究員，主要從事動物胚胎工程研究。