張秀娟

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271016;2.滕州市工人醫(yī)院病理科，山東滕州 277500)

人類表皮生長因子受體HER是一簇具有酪氨酸激酶活性的高同源性蛋白質(zhì)，是一種原癌基因。Slamon等［1］首先發(fā)現(xiàn)了Her-2基因，并且20% ～30%乳腺癌患者Her-2基因過度表達(dá)［2］。實驗證明Her-2擴(kuò)增與乳腺癌的進(jìn)展及不良預(yù)后有關(guān)，同時也是乳腺癌患者使用單克隆抗體赫賽汀治療的唯一指標(biāo)，因此在制訂乳腺癌患者的治療方案和預(yù)測預(yù)后前準(zhǔn)確了解Her-2基因擴(kuò)增及表達(dá)狀態(tài)是非常重要的。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)有敏感性高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，同時可以將17號染色體的非整倍體和單純的Her-2基因擴(kuò)增區(qū)分開來［4］，因此檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高。本研究收集篩選96例浸潤性乳腺癌石蠟切片作為研究對象。以FISH技術(shù)檢測Her-2基因擴(kuò)增狀態(tài)，并判斷其與免疫組化(IHC)結(jié)果之間的差異性和相關(guān)性，為腫瘤靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取滕州市中心人民醫(yī)院2011年2013年乳腺癌標(biāo)本96例，患者均為女性最小年齡28歲，最大76歲，均未接受術(shù)前放、化療，標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定至少6-8小時，其中浸潤性導(dǎo)管癌例94例，浸潤性小葉癌2例。

1.2 實驗試劑

FISH檢測用Her-2探針購自北京金菩嘉醫(yī)療科技公司，內(nèi)含GLPHER2/CSP17，CSP17為對照探針，探針緩沖液及DAPI復(fù)染劑，Her-2兔抗人單克隆抗體、免疫組織化學(xué)SP染色試劑盒，購自福建邁新生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 FISH(熒光原位雜交技術(shù))石蠟切片脫蠟、梯度復(fù)水后，置于50℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%酸性亞硫酸鈉20～30min，破壞細(xì)胞膜蛋白，37℃蛋白酶K消化10～20min，破壞細(xì)胞核核膜并使細(xì)胞核分散，0.1mol/LHCL室溫5～10min，使探針易進(jìn)入雜交，2xSSC漂洗2次，丙酮 2min，自然干燥玻片，73℃變性液5min，-20℃乙醇梯度脫水，玻片于48℃預(yù)熱5min，將2μl FISH 探針、7μl雜交緩沖液及 1μl水混勻，73℃水浴箱中變性5min，取出滴加至預(yù)熱玻片，加蓋玻片并橡膠封邊，濕盒中42℃過夜。46℃體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中10min×3次，2×SSC漂洗10min，46℃2 × SSC/0.1%NP-40 5min，室溫體積分?jǐn)?shù)70%乙醇3min，暗處自然干燥，滴加DAPI復(fù)染劑，暗處放置15min，中性樹脂封片。

判斷方法如下:GLP Her-2/CSPl7(CSPl7為對照探針，標(biāo)記染色體著絲粒)標(biāo)記顏色;紅/綠結(jié)果判讀計數(shù)腫瘤細(xì)胞集中，各通道信號清晰可辨，細(xì)胞核輪廓清楚無重疊的細(xì)胞30個，統(tǒng)計Ratio值(Ratio值=30個細(xì)胞核中紅信號總數(shù)/細(xì)胞核中綠信號總數(shù))Ratio＜1.8為陰性結(jié)果(見圖1)，提示該樣本無Her-2基因擴(kuò)增，Ratio＞2.2為陽性結(jié)果(見圖2)，提示樣本中Her-2基因發(fā)生擴(kuò)增，Ratio在1.8～2.2之間可以選擇增加計數(shù)細(xì)胞至100個或重做FISH實驗，每個細(xì)胞中綠色信號數(shù)3為17號染色體多體［5］。

1.3.2 IHC(免疫組化法)石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度復(fù)水后，于10mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中，水浴修復(fù)抗原3min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。正常兔血清封閉非特異性抗原15min，滴加兔抗人Her-2單克隆抗體，40℃放置過夜;滴加生物素化二抗，37℃放置30min;滴加SP，37℃放置30min。DAB顯色;蘇木素復(fù)染;中性樹脂封片。判讀方法［6］如下:Her-2的表達(dá)定位在細(xì)胞膜，無著色為0(見圖3);任何比例的浸潤癌細(xì)胞呈微弱不完整的細(xì)胞膜著色為(+)(見圖4);＞10%浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度完整但不均勻細(xì)胞膜棕黃色著色或＜30%的浸潤癌細(xì)胞呈強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜棕褐色著色為(++)(見圖5)，＞30%的浸潤癌細(xì)胞呈強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜棕褐色著色為(+++)(見圖6)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，IHC與FISH采用Kappa一致性檢驗分析，P＜0.05認(rèn)為兩種方法檢驗具有一致性。

圖1 Her-2基因擴(kuò)增

圖2 Her-2基因不擴(kuò)增

圖3 Her-2在癌組織中無細(xì)胞膜著色

圖4 Her-2在癌組織中呈微弱的、不完整的細(xì)胞膜著色

圖5 Her-2在癌組織中呈中等強(qiáng)度的完整但不均勻的細(xì)胞膜著色

圖6 Her-2在癌組織中呈較強(qiáng)的完整的細(xì)胞膜著色。

2 結(jié)果

FISH檢測96例浸潤性乳腺癌Her-2基因，Her-2基因擴(kuò)增24例，陽性率25%(24/96)，在IHC(±)標(biāo)本中，Her-2基因未擴(kuò)增67例，陰性符合率為94.37%;在IHC(++)標(biāo)本中，Her-2基因擴(kuò)增10例，陽性符合率71.43%;在IHC(+++)標(biāo)本中，Her-2基因擴(kuò)增 10例，陽性符合率90.91%(見表1)。

表1 FISH和IHC檢測Her-2表達(dá)

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐年上升［7］。Her-2基因在乳腺癌組織中的過度表達(dá)，不僅是乳腺癌的一個獨(dú)立的不良預(yù)后因素，還可以用來預(yù)測腫瘤對化療藥物的敏感度，如Her-2陽性者使用紫杉類化療較蒽環(huán)類效果更佳，更重要的是還可以把Her-2作為靶向治療［8-9］的目標(biāo)進(jìn)行個體化治療，為乳腺癌的治療開辟了一個新領(lǐng)域。大量臨床試驗證明，赫賽汀對于Her-2過度表達(dá)的乳腺癌患者有著顯著的療效，能提高患者的生存率和生活質(zhì)量，因此，目前針對乳腺癌進(jìn)行Her-2檢測已成常規(guī)，但靶向治療成本昂貴，并存在心臟不良反應(yīng)，因而Her-2檢測的準(zhǔn)確性非常重要，應(yīng)達(dá)到盡可能高的特異性和敏感性。

目前FDA批準(zhǔn)用于Her-2檢測的方法有IHC法和FISH法。IHC是臨床上常用的Her-2蛋白檢測方法，該方法操作簡便，價格低廉，可重復(fù)性好，對材料要求不高，在臨床上廣泛應(yīng)用，但是由于抗體差異、抗原修復(fù)方法不同、組織固定和制片以及結(jié)果的主觀判讀等，使不同醫(yī)院之間的結(jié)果差異較大。FISH技術(shù)易于定量檢測，更不容易受到組織樣本和觀察者主觀因素的影響，具有較高的準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性，是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的檢測Her-2基因擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)［10］。

本試驗分別使用FISH及IHC對96例乳腺癌的Her-2狀態(tài)進(jìn)行檢測，Her-2基因擴(kuò)增比例為25%，這一結(jié)果與多數(shù)研究結(jié)果相一致［11］，IHC陰性至強(qiáng)陽，Her-2基因擴(kuò)增的比例逐漸增高，這與其他研究結(jié)果相符，即Her-2蛋白免疫組化強(qiáng)度越高，患者Her-2基因擴(kuò)增的可能性就越大，同時結(jié)果表明IHC(±)和IHC(+++)時與FISH的結(jié)果符合率較高，參照國外的檢測經(jīng)驗，即在美國IHC(+++)為Her-2陽性，可接受治療;澳大利亞及歐洲一些國家，將IHC和FISH同時作為Her-2檢測的一線技術(shù)，我們認(rèn)為有條件的患者應(yīng)同時進(jìn)行FISH及IHC檢測，以排除假陰性及假陽性，如果沒有FISH檢測條件，可將IHC作為初步篩查手段，檢測結(jié)果為IHC(±)或(+++)對治療也有一定意義，但I(xiàn)HC(++)時Her-2基因擴(kuò)增符合率較低，若經(jīng)濟(jì)條件允許，還是建議進(jìn)行FISH的檢測，以免錯過了使用Herceptin治療的機(jī)會。

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