王 進，盧忠心，何於娟

(1武漢市中心醫(yī)院，武漢430014;2重慶醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室)

川楝素是從楝科植物川楝子和苦楝皮中提取出的一種四環(huán)三萜類化合物，近年研究發(fā)現(xiàn)，川楝素具有抑制腫瘤細胞增殖的作用［1］。本實驗室既往研究表明，川楝素在體外能有效誘導人白血病K562細胞和肝癌細胞凋亡［2，3］;但對川楝素誘導人慢性髓系白血病K562細胞發(fā)生自噬的研究鮮有報道。自噬性細胞死亡［4］是凋亡以外的另一種程序性細胞死亡形式，即Ⅱ型程序性細胞死亡，自噬活性的變化與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。2010年1月～2012年8月，我們對川楝素誘導K562細胞發(fā)生自噬的現(xiàn)象進行觀察，并初步探討川楝素誘導K562細胞自噬性死亡的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人慢性髓系白血病K562細胞株(中國科學院上海細胞生物學研究所);川楝素(純度≥95%，上海卓康生物有限公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物制品研究所);噻唑藍(MTT)、3-MA(Sigma公司);即用型SABC免疫組化試劑盒、兔抗人Beclin1、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)-ⅡIgG多克隆抗體、鹽酸二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人慢性髓系白血病K562細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含青霉素100 U/mL、鏈霉素 100 μg/mL)中，置于37℃、相對濕度95%、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗，購買回來的細胞株在用于本實驗時，最多傳代15代以內(nèi)。

1.2.2 MTT法檢測細胞的增殖情況 將對數(shù)生長期的K562細胞配制成濃度為5×104/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔加100 μL，加入不同濃度川楝素(終濃度分別為 10、30、50、70 nmol/L)。每組設5個平行孔，常規(guī)培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，置于溫箱中孵育4 h后離心，小心移除上層液體，再加入150 μL DMSO充分溶解孔內(nèi)紫色結(jié)晶。用酶標儀測定不同作用時間下細胞的吸光度(A492)，實驗重復5次，計算細胞增殖抑制率，并按中效方程計算IC50。細胞增殖抑制率=(1－A藥物/A對照)×100%。IC50=e{lg最大劑量－［lg(最大劑量/相鄰劑量)］［陽性反應率之和－(3－最大陽性反應率－最小陽性反應率)/4］}。

1.2.3 光鏡觀察細胞的形態(tài) 離心收集經(jīng)10、30、50 nmol/L川楝素作用72 h后的細胞，用PBS洗滌，涂片機甩片，瑞氏染色，光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.4 透射電鏡觀察K562細胞超微結(jié)構改變設陰性對照組、川楝素組(30、50 nmol/L)，川楝素作用72 h后，收集各組細胞，用 PBS洗滌，棄上清，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，透射電子顯微鏡下觀察并成像。

1.2.5 免疫細胞化學法檢測Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白的表達 30、50 nmol/L川楝素分別處理K562細胞72 h，離心，PBS沖洗，配制成1×106/mL單細胞懸液，甩片，4%多聚甲醛固定，3%H2O2溶液中室溫下浸泡15 min，滴加封閉血清，37℃孵育20 min，甩去多余液體，滴加相應一抗(1∶100)，同時用PBS代替一抗作陰性對照，4℃過夜，按照SABC免疫組化染色試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察，以胞質(zhì)和(或)胞膜有棕黃色顆粒為陽性。光鏡下以放大400倍數(shù)選取一定視野攝像，將圖片輸入計算機，應用圖像分析軟件進行圖像分析，Beclin1、LC3-Ⅱ染色的強弱代表組織中特定蛋白表達水平的高低。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 川楝素對K562細胞的增殖抑制作用 10、30、50、70 nmol/L川楝素分別作用 K562細胞后，K562細胞增殖被明顯抑制。隨著川楝素作用時間的延長，抑制作用逐漸增強，呈明顯的劑量和時間依賴性，IC50(72 h)為50 nmol/L(圖1)。

圖1 川楝素對K562細胞增殖的影響

2.2 K562細胞形態(tài)學觀察結(jié)果 陰性對照組K562細胞大小不一，呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)疏松，核仁清楚，胞質(zhì)多見瘤狀突起，K562細胞隨著川楝素作用濃度的增大，細胞數(shù)量逐漸減少，形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞質(zhì)出現(xiàn)大量大小不等的空泡，50 nmol/L川楝素組K562細胞胞質(zhì)內(nèi)空泡尤為明顯(圖2)。2.3 川楝素對K562細胞超微結(jié)構的影響 陰性對照組K562細胞可見細胞器、細胞核和染色體形態(tài)分布正常(圖3A)，30 nmol/L川楝素組可見K562細胞核周圍的胞質(zhì)內(nèi)形成大量的空泡，空泡內(nèi)含有細胞質(zhì)和線粒體等細胞器(圖3D)，50 nmol/L川楝素組胞質(zhì)中可見自噬體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體(圖3E、F)，隨著川楝素作用濃度的增加，胞質(zhì)內(nèi)自噬泡數(shù)量明顯增加，此超微結(jié)構明顯區(qū)別于凋亡及死亡細胞，是較為典型的自噬性細胞死亡形態(tài)。

圖2 K562細胞形態(tài)學變化(×600)

圖3 透射電鏡觀察K562細胞超微結(jié)構

2.4 川楝素對K562細胞Beclin1、LC3-Ⅱ表達的影響 Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白染色呈棕黃色顆粒，主要定位于細胞質(zhì)，免疫細胞化學法檢測顯示，30、50 nmol/L川楝素處理 K562細胞 72 h后，Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達較陰性對照組增強(圖4)。

圖4 K562細胞Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白的表達(×400)

3 討論

自噬是一個發(fā)生在真核細胞中由細胞初級溶酶體處理內(nèi)源性底物的重要生理過程，生命體借此維持蛋白代謝平衡及細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［5］。近年來，自噬與腫瘤之間的關系成為了研究焦點［6］。大量研究顯示，在一定條件下自噬對腫瘤細胞生長起到保護作用，而在某種情況下過度表達的自噬又會引發(fā)Ⅱ型程序性細胞死亡，即非凋亡形式的程序性細胞死亡［7］。川楝素是一種來源于天然植物的小分子化合物，具有廣泛的抗癌效應［8，9］，但機制尚不清楚。本研究以人慢性髓系白血病K562細胞為體外實驗模型，觀察川楝素作用后細胞形態(tài)學改變。倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，胞質(zhì)內(nèi)可見大量大小不等空泡，隨著川楝素濃度的增加，空泡逐漸增多。至目前為止，透射顯微鏡下超微結(jié)構的形態(tài)學檢測被認為是檢測自噬體的金標準。本文電鏡結(jié)果顯示，川楝素干擾的K562細胞內(nèi)可見大量自噬體和自噬溶酶體，自噬活性的增高使細胞內(nèi)大部分的胞質(zhì)和細胞器被破壞，最終導致細胞死亡，因此形態(tài)學上證實川楝素誘導K562細胞自噬性死亡。

自噬的整個過程受基因調(diào)控，LC3和Beclin1基因均是參與自噬體形成的重要基因。LC3有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種存在形式，LC3前體形成后，首先加工成胞質(zhì)可溶性形式LC3-Ⅰ，并暴露出其羧基末端的甘氨酸殘基;然后LC3-Ⅰ被Atg7活化、轉(zhuǎn)移，并被修飾成膜結(jié)合形式LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ定位于自噬體膜上，是自噬體的標志分子，LC3-Ⅱ的含量與自噬體數(shù)量的多少呈正比［10］。Beclin1也稱BECN1基因，是酵母ATG6的同系物，參與自噬調(diào)控的重要基因，其表達強度與自噬活性密切相關［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，川楝素處理后，隨著作用濃度的增加，LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達逐漸增強，進一步說明川楝素誘導K562細胞自噬性死亡的作用機制可能與LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白有關，從而激活自噬途徑。目前，自噬性細胞死亡是許多抗腫瘤藥物的作用機制之一，靶向自噬途徑有可能成為治療腫瘤的新方法［12，13］。前期實驗證實，川楝素能誘導K562細胞發(fā)生凋亡，其自噬與凋亡的關系有待進一步的研究，為川楝素的開發(fā)提供有利的理論依據(jù)。

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