王世成，王顏紅,*，劉艷輝，崔杰華，張 紅，齊 偉，李林平

(1.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016；2.中國綠色食品發(fā)展中心，北京 100081)

硒是人體必需的微量元素，具有抗氧化和增強(qiáng)免疫力的生物學(xué)功能[1]，對(duì)人體健康有著極為重要的意義。研究[2-4]表明，無機(jī)硒毒性大，生物活性低；而有機(jī)硒毒性小，吸收率高，生物利用率高，因此，有機(jī)硒產(chǎn)品的研制是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，其中富含有機(jī)硒的鴨蛋是常用的補(bǔ)硒產(chǎn)品之一，愈來愈受到重視。目前，在我國市場(chǎng)上已經(jīng)有富硒鴨蛋銷售，但是，由于缺乏有效的有機(jī)硒測(cè)試方法，使得富硒鴨蛋的質(zhì)量難以有效的控制。

目前，總硒的測(cè)定方法有分光光度法[5]、原子吸收光譜法[6]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[7]、氫化物-發(fā)生原子熒光光譜法[8]等等。對(duì)于樣品中有機(jī)硒的測(cè)定，有文獻(xiàn)報(bào)道采用分光光度法測(cè)定富硒酵母中有機(jī)硒的含量[9]；采用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測(cè)定富硒酵母中有機(jī)硒和無機(jī)硒[10]；采用順序注射氫化物發(fā)生原子熒光法測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中的無機(jī)硒和有機(jī)硒[11]；采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定硒蛋氨酸的方法[12]等。上述文獻(xiàn)的測(cè)試方法大多是針對(duì)植物、微生物產(chǎn)品，而動(dòng)物性食品中有機(jī)硒總量的測(cè)定方法還未見報(bào)道。對(duì)于鴨蛋中總硒的測(cè)定，有文獻(xiàn)報(bào)道了分光光度法測(cè)定富硒蛋粉中總硒含量的方法[13]和氫化物原子熒光光譜法測(cè)定雞蛋中總硒含量方法[14]。有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜-等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析富硒雞蛋中兩種硒代氨基酸[15]，但該方法對(duì)儀器和技術(shù)要求較高，不適宜普遍推廣應(yīng)用。為此，在能夠測(cè)定鴨蛋總硒的前提下，本方法采用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液提取，硫酸銨沉淀的方法，有效分離鴨蛋樣品中的無機(jī)硒和有機(jī)硒，采用原子熒光法測(cè)定其中的總硒和無機(jī)硒，應(yīng)用差減法計(jì)算有機(jī)硒的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通鴨蛋和富硒鴨蛋均采自遼寧省大連某蛋鴨養(yǎng)殖企業(yè)。

硝酸、高氯酸、鹽酸均為優(yōu)級(jí)純；pH8.6的Tris-HCl緩沖溶液：稱取1.211g三羥甲基氨基甲烷，0.404g MgCl2·6H2O，用80mL水將其溶解，用6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.6，用去離子水定容至100mL。NaBH4(20g/L)和NaOH(4g/L)的混合溶液：分別稱取6g NaBH4和1.2g NaOH，加入300mL去離子水將其溶解并定容，現(xiàn)用現(xiàn)配；鐵氰化鉀溶液(100g/L)：稱取10.0g鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶于100mL水中，混勻；硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1000mg/L。硒標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：取1000mg/L硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，分別得到質(zhì)量濃度為500μg/L和100μg/L的溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

AFS-2202E型原子熒光光譜儀(配有硒空心陰極燈) 北京海光儀器公司；KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；KGB-2型電熱板 沈陽市森華理化儀器研究所；TDL-40C型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 總硒的測(cè)定

按GB/T 5009.93—2003《食品中硒的測(cè)定》方法測(cè)定。

1.3.2 無機(jī)硒的測(cè)定

1.3.2.1 無機(jī)硒的提取

稱取混合均勻的鴨蛋樣品1g(精確到0.001g)，加入Tris-HCl緩沖溶液(pH8.6)10mL，超聲提取2h；4000r/min離心10min，移出上清液，加入6g硫酸銨，混勻，靜置10min，以4000r/min離心10min，移出清液；殘?jiān)性偌尤?.6g硫酸銨，同時(shí)加入1mL Tris-HCl緩沖溶液潤(rùn)洗后，離心，合并清液。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.2 提取液的消解

吸取離心后的提取清液(1.3.2.1節(jié))，加入10mL混酸(硝酸：鹽酸(4：1，V/V))，加熱消解，并及時(shí)補(bǔ)加混酸，待溶液變?yōu)槌吻鍩o色并伴有白煙時(shí)，繼續(xù)加熱至剩余量為1～2mL時(shí)；再加入5mL鹽酸溶液(6mol/L)，繼續(xù)加熱至清亮無色并伴有白煙出現(xiàn)，冷卻，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，加入鹽酸5.0mL、鐵氰化鉀溶液2.5mL，用去離子水定容至刻度，混勻待測(cè)。

1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

取50mL容量瓶6支，依次準(zhǔn)確加入100μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)使用液0、1.0、2.5、5.0mL和500μg/L的硒標(biāo)準(zhǔn)使用液2.0、5.0mL，分別加入鹽酸10.0mL、鐵氰化鉀溶液(100g/L)5.0mL，用去離子水定容至刻度(各相當(dāng)于硒質(zhì)量濃度0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/L)，混勻待測(cè)。

1.3.2.4 儀器測(cè)定條件

原子化器高度：8mm；燈電流：80mA；載氣流量：400mL/min；屏蔽氣流量：1000mL/min；原子化溫度：800℃；光電倍增管負(fù)高壓：300V；延遲時(shí)間：1s；讀數(shù)時(shí)間：12s；進(jìn)樣體積：1mL。

1.3.2.5 測(cè)定

在測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液后，分別吸取空白溶液和試樣溶液進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 有機(jī)硒總硒的含量減去無機(jī)硒的含量即得有機(jī)硒含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制硒質(zhì)量濃度為2.0～50μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按建立的方法，以硒質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=32.378x－50.631，R2=0.9999，測(cè)定質(zhì)量濃度在2.0～50μg/L線性關(guān)系良好，適用于樣品的測(cè)定分析。

2.2 提取劑的選擇

鴨蛋中的硒主要以蛋白的結(jié)合形式存在，Tris-HCl緩沖溶液可作為蛋白的理想提取試劑，因此采用該溶液作為鴨蛋中的有機(jī)硒和無機(jī)硒提取劑。參考文獻(xiàn)[7]考察在提取液中加入甘油增加提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取劑中添加一定量的甘油，在消解的過程中，容易產(chǎn)生過熱的迸濺現(xiàn)象影響結(jié)果的平行性，沒有添加甘油的測(cè)試結(jié)果平行性較好。故采用不含甘油的pH8.6的Tris-HCl緩沖溶液提取，以利于減少樣品在消解過程中的損失。

2.3 沉淀劑的選擇

表 1 不同沉淀劑的效果Table 1 Effect of different precipitant on the recovery of selenium

采用溶劑提取獲得有機(jī)硒和無機(jī)硒溶液后，通過沉淀蛋白的方式去除有機(jī)硒，比較采用硫酸銨和無水乙醇作為沉淀劑沉淀蛋白的效果。稱取1g樣品，加入一定量的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入10mL的pH8.6 Tris-HCl緩沖溶液，超聲提取2h，再分別加入0.6g硫酸銨固體和15mL無水乙醇沉淀蛋白，以4000r/min離心10min，上清液定容至25mL，按建立的方法消解分析，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，無水乙醇做沉淀劑有利于溶液和沉淀的分離，但測(cè)得的加標(biāo)回收率偏低。用硫酸銨固體作沉淀劑回收率較高，雖然溶液和沉淀不容易分離，但可通過高速離心和增加離心時(shí)間實(shí)現(xiàn)。故采用硫酸銨作為蛋白沉淀劑。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)和方法的檢出限

方法精密度：樣品中添加無機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量為0.4mg/kg、按照本方法確定的條件進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤5%。說明本方法用于測(cè)定鴨蛋中無機(jī)硒的含量有較好的精密度。

表 2 方法的精密度(n=5)Table 2 Precision test (n=5)

根據(jù)限量檢測(cè)要求，連續(xù)11次測(cè)量樣品空白對(duì)照液，按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算其檢出限(3σ)為0.09μg/L，按稱樣1g計(jì)算，定容25mL計(jì)算，無機(jī)硒的檢出限為0.003mg/kg。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

以普通鴨蛋為樣品，分別添加0.4、1.0mg/kg和2.0mg/kg的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，按建立的方法，測(cè)定了無機(jī)硒的回收率，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，3種加標(biāo)量的無機(jī)硒添加回收率在82.8%～91.0%之間，基本滿足樣品測(cè)定的需求，通過差減法得到的樣品的有機(jī)硒含量是真實(shí)可信的。

表 3 無機(jī)硒的回收率Table 3 Recoveries of inorganic selenium

2.6 樣品中有機(jī)硒的測(cè)定

表 4 樣品中有機(jī)硒和無機(jī)硒的測(cè)定 Table 4 Determination of organic selenium and inorganic selenium in samples

按照建立的方法，測(cè)定了3批富硒鴨蛋樣品中無機(jī)硒和有機(jī)硒含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，富硒鴨蛋中的有機(jī)硒占總硒的95.2%和95.9%，無機(jī)硒占總量的4.8%和4.1%，無機(jī)硒的測(cè)定結(jié)果與Lipiec等[15]分析結(jié)果基本相符。Lipiec分析富硒雞蛋中的硒蛋氨酸和硒半胱氨酸，二者的總和占總硒的75%，無機(jī)硒占總量的6.4%，說明兩種硒代氨基酸的含量只代表了大部分有機(jī)硒但并不是全部。

3 結(jié) 論

建立了鴨蛋中有機(jī)硒和無機(jī)硒的測(cè)定方法，采用Tris-HCl緩沖溶液提取，硫酸銨沉淀，原子熒光法測(cè)定其中的總硒和無機(jī)硒，采用差減法計(jì)算有機(jī)硒的含量，方法靈敏度高，線性范圍，精密度以及加標(biāo)回收率均獲得滿意結(jié)果。為鴨蛋中有機(jī)硒和無機(jī)硒的測(cè)定提供了一種完善檢測(cè)方法。

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