張劍光，徐 彥，劉 圓，呂露陽，曾 銳，張志鋒*

(西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所，四川 成都 610041)

川貝母為百合科貝母屬多種植物的干燥鱗莖，其中包括川貝母(卷葉貝母)、暗紫貝母、甘肅貝母或梭砂貝母等[1-2]。川貝母是食療佳品，可單獨研粉服用或者與梨蒸服，有清熱潤肺、化痰止咳的功效，與冰糖同食，其化痰止咳、潤肺養(yǎng)陰的效果更加明顯[3]。川貝母中含有多種類型化學(xué)成分，包括多糖、生物堿、核苷等?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，總生物堿是其主要有效成分[4-6]，其藥理活性廣泛，包括鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗菌、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、心血管活性等。近年來有關(guān)川貝母鱗莖中生物堿含量的研究已有較多報道[7-12]，有關(guān)地上部分的研究較少，吳啟秀等[13]對川貝母地下和地上部分的HPLC指紋圖譜進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)其含有一些相似的化學(xué)成分，但未進(jìn)行含量測定。由于川貝母的大多來自野生資源，需求逐漸加大，導(dǎo)致野生資源日趨匱乏，因而其地上部分的食療價值也逐漸受到關(guān)注。

鑒此，本實驗對川貝母的資源品種之一卷葉貝母的莖、葉中的總生物堿進(jìn)行研究，運用響應(yīng)面設(shè)計試驗優(yōu)化其總生物堿的提取工藝，并定量比較了人工種植和野生卷葉貝母莖、葉中的總生物堿含量差異，以期為川貝母植物的綜合利用及擴(kuò)大藥源方面的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生卷葉貝母的莖和葉采于四川省康定縣折多山(海拔3800m)；人工種植卷葉貝母莖和葉采于四川省康定縣新都橋(海拔3400m)。

貝母素乙對照品(批號：110751-200709) 中國食品藥品檢定研究院；溴麝香草酚藍(lán) 新中化學(xué)廠；鄰苯二甲酸氫鉀 成都化學(xué)試劑廠；濃氨水 成都化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Unicam UV-500紫外分光光度計 美國熱電公司；Mettler AE240電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器公司；W201B恒溫水浴鍋 上海申順生物科技有限公司；多功能粉碎機(jī) 廣州雷邁公司。

1.3 方法

1.3.1 川貝母莖葉中總生物堿的提取

取川貝母莖、葉粉末0.5g，精密稱定置于50mL圓底燒瓶中，加入適量濃氨試液浸泡一段時間，加入氯仿-甲醇混合溶劑，水浴加熱回流提取，按照單因素考察、響應(yīng)面設(shè)計表設(shè)定的條件進(jìn)行提取，放冷過濾，揮干溶劑，用甲醇定容至25mL，靜置。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的貝母素乙對照品0.0125g，用甲醇溶解定容于25mL的容量瓶中，然后再精密吸取1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5mL分別定容于10mL容量瓶中。分別吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)品，置分液漏斗中，加氯仿14mL，鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液緩沖液(pH5.0)5mL，溴麝香草酚藍(lán)溶液2mL，充分振搖，靜置30min使充分分層，取下層氯仿液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，在415nm處測定其吸光度[8]。以貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度做橫坐標(biāo)、吸光度做縱坐標(biāo)，其回歸方程為Y＝4.799X－0.1353，R2＝0.9993，表明貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在0.050～0.25mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

1.3.3 貝母總生物堿的含量計算

精密吸取樣品溶液1mL，按1.3.2節(jié)中的測定方法測定其吸光度，重復(fù)3次，取其平均值為最終吸光度，再依據(jù)線性方程計算1mL樣品溶液中所含貝母總生物堿的量(mg)，即樣品溶液貝母總生物堿的質(zhì)量濃度(mg/mL)，根據(jù)以下公式計算貝母總生物堿的含量。

式中：C為貝母總生物堿的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為提取液定容體積/mL；m為貝母粉末質(zhì)量/g。

1.3.4 單因素試驗

稱取0.5g川貝母莖粉末分別加入4倍體積的氨水浸泡4h后，加入20倍體積混合溶劑(氯仿：甲醇＝4：1)，70℃水浴回流4h，以吸光度為指標(biāo)評價提取效果，固定其他條件，分別考察氨水浸泡時間(1～8h)、液料比(10：1：1～50：1)、提取溫度(30～90℃)、提取時間(2～10h)對吸光度的影響。

1.3.5 響應(yīng)面設(shè)計試驗

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果和Box-Behnken試驗設(shè)計原理[14]，選取影響貝母莖總生物堿提取效果的主要因素氨水浸泡時間、提取時間、液料比、提取溫度，對這4個因素均設(shè)定3水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 氨水浸泡時間

圖 1 氨水浸泡時間對總生物堿提取的影響Fig.1 Effect of ammonia soaking time on the extraction effi ciency of total alkaloids

從圖1可以看出，氨水浸泡時間對總生物堿的提取效果影響很大，提取效果隨氨浸泡時間的延長先增大后減小，浸泡時間為4h時達(dá)到最佳，隨后隨時間的延長而迅速減小。

2.1.2 液料比

圖 2 液料比對總生物堿提取效果的影響Fig.2 Effect of ratio of liquid to solid material on the extraction effi ciency of total alkaloids

從圖2 可以看出，開始時貝母總生物堿的提取效果隨液料比的增加而增大，增幅較明顯，說明此因素對提取效果的影響較大。當(dāng)液料比達(dá)到3 0：1時，貝母總生物堿提取效果最好，繼續(xù)增大液料比時，總生物堿的溶出不再增加，故選擇30：1為最宜液料比。

2.1.3 提取溫度

圖 3 提取溫度對總生物堿提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction effi ciency of total alkaloids

從圖3可以看出，提取溫度對莖的總生物堿提取效果影響較大，提取效果隨溫度呈先上升后下降的趨勢，70℃時提取效果最好。這是因為溫度的升高，液體黏度下降，分子運動加快，加快溶質(zhì)的擴(kuò)散和溶劑的滲透，有利于生物堿的溶出，但隨著溫度的升高，部分熱穩(wěn)定性小的生物堿也會隨之分解而影響貝母總生物堿的提取率。

2.1.4 提取時間

圖 4 提取時間對總生物堿提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction effi ciency of total alkaloids

從圖4可以看出，提取時間對總生物堿提取效果的影響也很大，提取效果隨提取時間的延長而先增大后減小，這可能是因為延長提取時間有利于藥材粉末和提取溶劑的充分接觸，利于貝母堿的溶出。但隨時間的延長也有可能會導(dǎo)致部分生物堿的分解而使提取效果下降。故莖的最宜提取時間為6h。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 模型的建立及顯著性試驗

表1 莖響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果Table 1 Response surface design matrix with experimental and predicted values of total alkaloid content of F. cirrhosa D. Don leaves

表2 回歸統(tǒng)計分析表Table 2 ANOVA for the response surface regression model

根據(jù)表1的結(jié)果，運用Design-Exper 7.0軟件對表2中的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合回歸，得回歸方程：Y＝1.54＋0.29A－1.54B＋0.45C＋0.013D＋0.045AB＋0.11AC－0.12AD＋0.19BC－0.20BD－0.090CD－0.41A2－0.48B2－0.43C2－0.39D2。模型系數(shù)顯著性結(jié)果和方差分析結(jié)果見表2。

表2的數(shù)據(jù)可知，該模型極顯著(P＜0.0001)，模型的R2＝0.9799，調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Adj＝0.9188，模型失擬項P＝0.0747＞0.05，不顯著，說明該模型顯著，本試驗所得的二次回歸方程能很好地對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測，擬合度好。

從表2可看出，一次項B，交互項BC、BD，二次項A2、B2、C2、D2表現(xiàn)為極顯著；一次項A、C，交互項AD表現(xiàn)為顯著；一次項D、交互項AB、AC、CD表現(xiàn)為不顯著。比較各因素的F值，可得出各因素多實驗結(jié)果的影響的大小順序B＞C＞A＞D，即提取時間＞液料比＞浸泡時間＞提取溫度。

2.2.2 響應(yīng)面圖分析

利用Design-Exper 7.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸多元擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面圖見圖5。

圖 5 兩因素交互作用對貝母莖總生物堿得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of process parameters on the extraction effi ciency of total alkaloids from F. cirrhosa D. Don stems

該圖形直觀地給出了各因素交互作用響應(yīng)面的3D圖，從響應(yīng)面的最高點可以看出，在所選范圍內(nèi)存在極值。從響應(yīng)面曲面坡度的陡峭程度和等高線圖可以看出因素間交互作用的強(qiáng)弱和因素對響應(yīng)值的影響程度。圖5表明提取時間和液料比的交互作用、提取時間和提取溫度的交互作用、氨水浸泡時間和提取溫度的交互作用較顯著。以圖5Ⅰ為例說明，在液料比30：1、提取溫度70℃的條件下，總生物堿含量隨提取時間的延長先增加后減小，亦隨氨水浸泡時間的延長先增加后減小。其他各圖依此分析，其分析結(jié)果與單因素試驗結(jié)果基本一致。

2.2.3 最佳提取工藝的優(yōu)化

由Design-Exper 7.0軟件分析得到川貝母莖中總生物堿最佳提取工藝條件。莖的最佳工藝條件為氨水浸泡時間4.12h、提取時間6.37h、液料比30.74：1、提取溫度73.69℃，在此條件下提取總生物堿，含量可達(dá)2.8577mg/g。進(jìn)行驗證實驗，將莖的最佳提取條件修正為氨水浸泡時間4h、提取時間6.5h、液料比31：1、提取溫度74℃，此條件下，人工種植川貝母莖中總堿的含量為2.7851mg/g，與理論預(yù)測值非常接近，因此，該方程能較真實地反映各因素對總堿提取效果的影響情況。

2.3 人工種植和野生川貝母莖、葉中總堿的含量比較

依據(jù)優(yōu)化后的總生物堿提取工藝條件，對人工種植和野生川貝母的莖、葉進(jìn)行總生物堿的提取，測定其含量，其結(jié)果見圖6。

圖 6 川貝母莖和葉中總堿含量結(jié)果Fig.6 Total alkaloid content of stems and leaves of wild and cultivated F. cirrhosa

3 結(jié) 論

綜合單因素和響應(yīng)面設(shè)計試驗的結(jié)果，得出川貝母莖中總生物堿的最佳提取工藝為藥材粉碎粒度60目、4倍體積氨水浸泡、氨水浸泡時間4h、混合溶劑氯仿-甲醇(1：1)、液料比31：1、提取時間6.5h、水浴溫度74℃，此條件下，提取人工種植和野生川貝母莖、葉的總生物堿，得人工種植川貝母莖總生物堿含量為2.785mg/g，葉為3.708mg/g。野生莖總生物堿含量為3.235mg/g，葉為4.998mg/g。結(jié)果表明莖的總生物堿含量低于葉中的，同時人工種植的也低于野生的。

川貝母傳統(tǒng)的用藥部位是地下鱗莖，但川貝母莖、葉中含有較高的生物堿類成分，具體的成分還有待進(jìn)一步的研究分析。本研究前期已經(jīng)對地下鱗莖中總生物堿的最佳工藝進(jìn)行了研究，表明地上部分總生物堿的含量高于地下部分，因此，川貝母的地上部分是否也可以作為食療佳品使用，其功能特點值得進(jìn)一步的研究。

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