索化夷，黃業(yè)傳，李 鍵*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué) 國家食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，重慶 400715；3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010；4.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

臘肉的風(fēng)味形成是一個(gè)漫長而又復(fù)雜的過程，很多學(xué)者都對臘肉的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了鑒定，如Y U Ainong[1-2]、Kostyra[3]、張純[4]等研究了煙熏臘肉，成波[5]研究了湘味臘肉，許鵬麗等[6]研究了廣味臘肉、Xie等[7]等研究了煙熏烤乳豬的風(fēng)味，另外閆文杰等[8]研究了添加酶對快速腌制臘肉風(fēng)味的影響，馮彩平等[9]研究了快速成熟對低鹽臘肉揮發(fā)性成分的影響。到目前共鑒定出各類揮發(fā)性物質(zhì)幾百種，主要有醛類、醇類、酯類、酚類、酮類、酸類、雜環(huán)類、烴類等，但大部分研究僅限于對成品中揮發(fā)性物質(zhì)的分離鑒定或比較不同工藝加工產(chǎn)品的風(fēng)味物質(zhì)差異，而對風(fēng)味物質(zhì)的形成過程研究較少。劉士健[10]、尚永彪[11]、吳金鳳[12]等對臘肉各加工階段的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了比較，探究了臘肉風(fēng)味形成的初步規(guī)律，但每個(gè)加工階段都鑒定出了幾十甚至上百種揮發(fā)性物質(zhì)，單從這些揮發(fā)性物質(zhì)種類、峰面積或峰面積百分比變化的大量數(shù)據(jù)中實(shí)在難以找出臘肉風(fēng)味的形成規(guī)律，因?yàn)榇蠖鄶?shù)物質(zhì)特別是烴類、飽和醇類、部分酮類等閾值都較高，因此鑒定出的大部分揮發(fā)性物質(zhì)都不是臘肉的特征風(fēng)味成分，只有對決定臘肉風(fēng)味成因的少數(shù)微量成分進(jìn)行定量分析才有積極意義。

重慶農(nóng)家臘肉是消費(fèi)者很喜愛的一種地方傳統(tǒng)腌臘制品，但現(xiàn)市場上有很多次品來冒充重慶農(nóng)家臘肉，或有一些沒有完全成熟的農(nóng)家臘肉，消費(fèi)者購買時(shí)難以準(zhǔn)確鑒別，這在一定程度上影響了重慶農(nóng)家臘肉的聲譽(yù)。判別分析是用以判斷樣品所屬類別的一種統(tǒng)計(jì)方法，它是根據(jù)已知類別的樣品與其若干個(gè)觀測量的關(guān)系對樣品分類建立模型，從而能夠判斷新樣品的所屬類別，現(xiàn)在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[13-15]。因此本研究采用SPME結(jié)合GC-MS技術(shù)對重慶農(nóng)家臘肉各加工各階段的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，并用判別分析法研究各加工階段揮發(fā)性化合物的形成特點(diǎn)，探索用特征揮發(fā)性化合物的峰面積或峰面積占總面積的百分比來判斷農(nóng)家臘肉加工程度的可行性，為進(jìn)一步探究川味臘肉的風(fēng)味形成機(jī)理、提高川味臘肉的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臘肉加工及樣品采集

在重慶奉節(jié)縣興隆鎮(zhèn)進(jìn)行農(nóng)家臘肉的加工，時(shí)間為冬季，當(dāng)?shù)睾０屋^高，冬季當(dāng)?shù)貧鉁囟嘣冢?0～10℃間。選取豬肋骨肉，切成長方形小塊，每塊約250g，然后進(jìn)行腌制，食鹽用量為6%～7%左右，時(shí)間為3d，腌制結(jié)束后懸掛于農(nóng)家灶堂的正上方，利用三餐煮飯或取暖燒柴產(chǎn)生的煙進(jìn)行煙熏，每日約6～8h，共30d，燃料以木材、松樹枝、柏樹枝為主。煙熏結(jié)束后，懸掛于通風(fēng)良好的房間進(jìn)行后熟，時(shí)間為30d。

分別取原料(A樣品)、腌制后樣品(B樣品)、煙熏前期樣品(煙熏第10天，C樣品)、煙熏中期樣品(煙熏第20天，D樣品)、煙熏結(jié)束樣品(煙熏第30天，E樣品)、成熟后樣品(F樣品)各6份，每份約100g，作分析用。樣品分析前于－20℃凍藏。

1.2 儀器與試劑

GCMS-QP2010 Plus型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；75μm CAR/PDMS萃取頭、手動(dòng)SPME進(jìn)樣器 美國Supelco公司。

C5～C24正構(gòu)烷烴混標(biāo) 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS分析

1.3.1.1 固相微萃取

稱取3.0g待測樣品于15mL樣品瓶內(nèi)，在60℃水浴預(yù)熱15min后，將固相微萃取器插入樣品瓶中并推出萃取頭，使其暴露在樣品瓶中樣品的上部，于60℃萃取30min，萃取結(jié)束后，將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口于250℃解吸5min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

1.3.1.2 GC-MS條件

氣相色譜：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；載氣為氮?dú)猓魉賚mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃，分流比5：1；起始溫度為35℃，保持3min，以4℃/min升到130℃并保持2min，最后以8℃/min升到230℃并保持5min。

質(zhì)譜：電離方式為電子電離源(electron ionization，EI)；電子能量70eV；接口溫度250℃；離子源溫度230℃；燈絲電流150μA；掃描質(zhì)量范圍35～450u。

1.3.1.3 定性與定量分析

各化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與系統(tǒng)自帶的數(shù)據(jù)庫(NIST05和NIST05S)相匹配。并采用正構(gòu)烷烴混標(biāo)(C5～C24)在相同條件下進(jìn)行分析，按照van den Dool等[16]的方法計(jì)算各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的保留指數(shù)(RI)，僅報(bào)道相似指數(shù)(SI)大于80以及RI與文獻(xiàn)[1,17-20]比較定性的化合物。利用峰面積及峰面積占總面積的百分比進(jìn)行定量分析。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)分析

為探索臘肉各加工階段特征風(fēng)味物質(zhì)的變化，分別以36個(gè)樣品中鑒定出的188種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積和峰面積占總面積的百分比為自變量，以不同加工階段為類別變量，用SPSS 13.0的Discriminant程序?qū)εD肉加工的不同階段進(jìn)行Fisher判別分析，按照Wilks的λ統(tǒng)計(jì)量最小的原則逐個(gè)分析每個(gè)化合物對模型判別能力的貢獻(xiàn)，直到模型中所有變量都符合留在模型中的判劇，模型外的變量都不符合進(jìn)入模型的判據(jù)時(shí)為止，最后建立判別函數(shù)并進(jìn)行樣品的回代檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 以揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對臘肉加工階段進(jìn)行判斷

在6個(gè)不同加工階段的36個(gè)樣品中共鑒定出揮發(fā)性風(fēng)味成分188種，其中包括醛類、酮類、醇類、酚類、醚類、酯類、酸類、雜環(huán)類等。應(yīng)用SPSS 13.0的Discriminant程序，以這188種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積為自變量對臘肉的加工程度進(jìn)行判別分析，共有20個(gè)變量進(jìn)入模型，如表1所示。共得到5個(gè)典則判別函數(shù)，其特征值分別為177717.0、6298.5、2810.7、463.9和31.6，方差貢獻(xiàn)率分別為94.9%、3.4%、1.5%、0.2%和0，其中前2個(gè)典則判別函數(shù)的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)98.2%，因此，前2個(gè)典則函數(shù)的判別分類結(jié)果基本能夠代表用5個(gè)判別函數(shù)進(jìn)行分類的結(jié)果，這樣就簡化了模型，前2個(gè)典則判別函數(shù)分別為：

式中：Xi代表進(jìn)入模型的第i個(gè)化合物的峰面積，在本例中i的取值為1～20，1～20分別代表的物質(zhì)如表1所示。

表1 基于峰面積的Fisher線性判別函數(shù)系數(shù)Table 1 Coefficients of Fisher’s linear discriminant functions based on peak area

將36個(gè)樣品中檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積數(shù)據(jù)代入這2個(gè)典則判別函數(shù)并作散點(diǎn)圖，結(jié)果如圖1所示，可以看出，各加工階段的6個(gè)樣品重復(fù)性很好；就各加工階段而言，雖然原料(A)和腌制后的樣品(B)在圖中位置較接近，但建立的判別函數(shù)還是能將二者很好地區(qū)分，表明進(jìn)入模型的20種化合物的峰面積可以較好地反映各加工時(shí)期揮發(fā)性化合物的特征，取得的判別模型可以區(qū)分農(nóng)家臘肉的不同加工階段。

進(jìn)入到判別函數(shù)的物質(zhì)，判別系數(shù)越大者越是評判樣品類別的關(guān)鍵因素。在第1個(gè)判別函數(shù)Y1中，2,6-二甲氧基苯酚、α-長葉蒎烯、香氣質(zhì)的系數(shù)最大，其次是4-乙基環(huán)己酮、吡咯、二甲基三硫、苯甲基甲醚、壬酸乙酯，因此這些物質(zhì)是評判樣品類別的最主要因素；在第2個(gè)判別函數(shù)Y2中，二甲基三硫、α-長葉蒎烯、棕櫚酸乙酯、γ-辛內(nèi)酯、乙酸乙酯的系數(shù)大于其他物質(zhì)，這些物質(zhì)也是評價(jià)樣品類別的重要因素。

圖 1 基于峰面積的典則判別函數(shù)散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter plot of canonical discriminant functions according to peak area

典則判別函數(shù)直觀描述了不同加工時(shí)間對臘肉風(fēng)味物質(zhì)的影響，但不便于對未知臘肉樣品的加工階段進(jìn)行判別。因此，以進(jìn)入模型的20種化合物的峰面積為基礎(chǔ)，建立了6個(gè)Fisher線性判別函數(shù)，其模型為：

式中：Zi代表各加工階段的Fisher線性判別函數(shù)值；Ki代表各加工階段Fisher線性判別函數(shù)的常數(shù)項(xiàng)(表1)，其中i代表加工的6個(gè)階段，取值為A、B、C、D、E和F；Xj代表進(jìn)入Fisher線性判別函數(shù)的第j個(gè)化合物的峰面積，在本例中j的取值為1～20，1～20分別代表的物質(zhì)如表1所示；Rij代表進(jìn)入Fisher線性判別函數(shù)模型的第i個(gè)加工階段的第j個(gè)化合物的Fisher線性判別函數(shù)系數(shù)(表1)，i和j的取值范圍同上。

根據(jù)上述模型建立的6個(gè)Fisher線性判別函數(shù)分別為：

表2 利用Fisher線性判別函數(shù)對原樣品的回代判別結(jié)果Table 2 Discrimination results of the original samples re-discriminated by Fisher’s linear discriminant functions

作判別分析時(shí)，將測得的某個(gè)樣品的上述20種物質(zhì)的峰面積資料分別代入6個(gè)方程計(jì)算函數(shù)值，根據(jù)分值大小判斷其所屬類別，哪個(gè)分值大就屬于相應(yīng)的加工階段。

根據(jù)建立的Fisher線性判別函數(shù)用自身驗(yàn)證法和交叉驗(yàn)證法對原樣品進(jìn)行回判，結(jié)果如表2所示，自身驗(yàn)證法的回判正確率為100%；而用交叉驗(yàn)證法進(jìn)行回判時(shí)，有2個(gè)樣品出現(xiàn)了誤判，將煙熏末期的樣品(E)誤判成了成熟后的樣品(F)，總的回判正確率為94.4%，因此建立的判別函數(shù)判別效果良好。

2.2 以揮發(fā)性物質(zhì)峰面積的百分比對臘肉加工階段進(jìn)行判斷

按照相同的方法，以36個(gè)樣品中鑒定的188種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積百分比為自變量對臘肉的加工程度進(jìn)行判別分析，共有21個(gè)變量進(jìn)入模型，如表3所示。共得到5個(gè)典則判別函數(shù)，其特征值分別為58169.303、8502.557、6016.585、489.471和71.808，方差貢獻(xiàn)率分別為79.4%、11.6%、8.2%、0.7%和0.1%，其中前2個(gè)典則判別函數(shù)的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)91.0%，因此，前2個(gè)典則函數(shù)的判別分類結(jié)果基本能夠代表用5個(gè)判別函數(shù)進(jìn)行分類的結(jié)果，前2個(gè)典則判別函數(shù)分別為：

式中：Xi代表進(jìn)入模型的第i個(gè)化合物的峰面積，在本例中i的取值為1～21，1～21分別代表的物質(zhì)如表3所示。

表3 基于峰面積百分比的Fisher線性判別函數(shù)系數(shù)Table 3 Coefficients of Fisher’s linear discriminant functions based on peak area percentage

將36個(gè)樣品中檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積百分比數(shù)據(jù)代入這2個(gè)典則判別函數(shù)并作散點(diǎn)圖，結(jié)果如圖2所示，可以看出，各加工階段的6個(gè)樣品重復(fù)性很好，各加工階段間也區(qū)別得很好，因此建立的函數(shù)能將各個(gè)加工階段很好地區(qū)分，表明進(jìn)入模型的21種化合物的峰面積百分比可以很好地反映各加工時(shí)期揮發(fā)性化合物的特征。

圖 2 基于峰面積百分比的典則判別函數(shù)散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plot of canonical discriminant functions according to peak area percentage

同樣，進(jìn)入到判別函數(shù)的物質(zhì)，判別系數(shù)越大者越是評判樣品類別的關(guān)鍵因素。經(jīng)比較，亞油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、2,6-二甲氧基苯酚、2-甲基吡咯、2,3-二甲基吡嗪、(E)-2-癸烯醛、2-壬酮、雪松醇、壬酸乙酯等物質(zhì)是評判樣品類別的最主要因素。

表3是用揮發(fā)性化合物的峰面積百分比建立的6個(gè)Fisher線性判別函數(shù)的系數(shù)表。用自身驗(yàn)證法和交叉驗(yàn)證法對原樣品進(jìn)行回判時(shí)，兩種驗(yàn)證結(jié)果回判正確率均為100%(數(shù)據(jù)略)，表明所建立的判別函數(shù)判別效果良好。

因此，以峰面積或峰面積占總面積的百分比為自變量，均可建立判別模型對臘肉加工的不同階段進(jìn)行判定，兩種方法相比較而言，以峰面積百分比為自變量建立的模型判別效果更好，6個(gè)加工階段在典則判別函數(shù)的第1和第2主成分散點(diǎn)圖上區(qū)分效果明顯，在用交叉驗(yàn)證法對原樣品回代檢驗(yàn)時(shí)其回判正確率達(dá)100%；而以峰面積為自變量建立判別模型時(shí)，原料和腌制后樣品在典則判別函數(shù)的散點(diǎn)圖上有部分重復(fù)，且在用交叉驗(yàn)證法對原樣品進(jìn)行回代檢驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)了兩個(gè)錯(cuò)判樣品。

另外，從建立的判別函數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，分別進(jìn)入兩套判別函數(shù)的揮發(fā)性物質(zhì)大都不同，只有2,6-二甲氧基苯酚、乙酸乙酯和壬酸乙酯3種物質(zhì)同時(shí)進(jìn)入了兩套判別系統(tǒng)，這表明臘肉加工中揮發(fā)性化合物既存在著絕對含量的變化，也存在相對含量的變化，兩者變化規(guī)律并不一致。峰面積的變化代表某物質(zhì)絕對含量的變化，而峰面積百分比的變化則代表該物質(zhì)相對含量的變化。進(jìn)入判別函數(shù)的物質(zhì)不一定是絕對含量或相對含量高的物質(zhì)，而是最能體現(xiàn)不同加工階段風(fēng)味變化的特征化合物，有些物質(zhì)如2,3-二甲基吡嗪、2-甲基吡咯雖然在各階段絕對含量和相對含量都很低，但其相對含量的變化能夠體現(xiàn)不同加工階段風(fēng)味的差異，因此兩者都進(jìn)入了第2套判別系統(tǒng)；有些物質(zhì)如己醛的百分含量在腌制后樣品中雖然達(dá)到了40%以上，但其并沒有進(jìn)入任何一套判別函數(shù)，說明其絕對含量或相對含量的變化相對于其它物質(zhì)來說還不足以體現(xiàn)各加工階段的差異。

3 結(jié) 論

3.1 用臘肉加工中揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對臘肉的加工程度進(jìn)行判別分析時(shí)，共有20種物質(zhì)進(jìn)入判別模型，根據(jù)建立的判別模型用自身驗(yàn)證法和交叉驗(yàn)證法對原樣品進(jìn)行回判時(shí)，自身驗(yàn)證法的回判正確率為100%，交叉驗(yàn)證法的回判正確率為94.4%。

3.2 用臘肉加工中揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積百分比對臘肉的加工程度進(jìn)行判別分析時(shí)，共有21種物質(zhì)進(jìn)入判別模型，根據(jù)建立的判別模型用自身驗(yàn)證法和交叉驗(yàn)證法對原樣品進(jìn)行回判時(shí)，回判正確率均為100%。

3.3 可利用重慶農(nóng)家臘肉加工中一些特征性揮發(fā)物質(zhì)的含量或比例的變化建立模型區(qū)分臘肉的加工程度。

[1] YU Ainong, SUN Baoguo, TIAN Dating, et al. Analysis of volatile compounds in traditional smoke-cured bacon (CSCB) with different fiber coatings using SPME[J]. Food Chemistry, 2008, 110(1)： 233-238.

[2] YU Ainong, SUN Baoguo. Flavour substances of Chinese traditional smoke-cured bacon[J]. Food Chemistry, 2005, 89(2)： 227-233.

[3] KOSTYRA E, BARYLKO-PIKIELNA N. Volatiles composition and flavour profile identity of smoke flavourings[J]. Food Quality and Preference, 2006, 17(1/2)： 85-95.

[4] 張純, 張智勇. 臘肉風(fēng)味成分的分析[J]. 肉類研究, 1992, 6(3)： 33-37.

[5] 成波. 湘西臘肉生產(chǎn)工藝的改進(jìn)及對風(fēng)味影響的研究[D]. 長沙： 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[6] 許鵬麗, 郭祀遠(yuǎn). 廣式臘肉風(fēng)味物質(zhì)成分分析的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 30(11)： 122-125.

[7] XIE J C, SUN B G, WANG S B. Aromatic constituents from Chinese traditional smoke-cured bacon of mini-pig[J]. Food Science and Technology International, 2008, 14(4)： 329-340.

[8] 閆文杰, 李興民, 何立千, 等. 添加酶對快速腌制臘肉風(fēng)味的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(4)： 175-177.

[9] 馮彩平, 劉美玉, 鄭立紅, 等. 快速成熟低鹽臘肉揮發(fā)性成分的初步研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2012, 12(1)： 206-212.

[10] 劉士健. 臘肉加工過程中主體風(fēng)味物質(zhì)變化研究[D]. 重慶： 西南大學(xué), 2005.

[11] 尚永彪, 吳金鳳, 夏楊毅, 等. 農(nóng)家臘肉冷熏加工過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(17)： 79-83.

[12] 吳金鳳. 重慶農(nóng)家臘肉風(fēng)味物質(zhì)研究及其安全性評價(jià)[D]. 重慶： 西南大學(xué), 2008.

[13] 趙改名, 柳艷霞, 田瑋, 等. 基于判別分析法的金華火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成過程分析[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2008, 24(3)： 260-264.

[14] 魯立強(qiáng), 金成國, 馬玉梁, 等. Fisher判別分析在蘋果品質(zhì)鑒定中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(7)： 356-359.

[15] 郝紅濤, 趙改名, 柳艷霞, 等. 利用硬度、脆性和黏著性對火腿腸等級的判別分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 43(10)： 2182-2188.

[16] van den DOOL H, KRATZ P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography[J]. Journal of Chromatography, 1963, 11(8)： 463-471.

[17] LU Ping, LI Defa, YIN Jingdong, et al. Flavor differences of cooked longissimus muscle from Chinese indigenous pig breeds and hybrid pig breed (Duroc×Landrace×Large White)[J]. Food Chemistry, 2008, 107(4)： 1529-1537.

[18] VENTANAS S, ESTEVEZ M, ANDRES A, et al. Analysis of volatile compounds of Iberian dry-cured loins with different intramuscular fat contents using SPME-DED[J]. Meat Science, 2008, 79(1)： 172-180.

[19] MEYNIER A, NOVELLI E, CHIZZOLINI R, et al. Volatile compounds of commercial Milano salami[J]. Meat Science, 1999, 51(2)： 175-183.

[20] BERDAGUE J, DENOYER C, LE QUERE J, et al. Volatile components of dry-cured ham[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1991, 39(7)： 1257-1261.