李鋒，徐平，黃庶冰，溫順華，劉暉，黃庶識

1(廣西科學(xué)院生物物理實驗室，廣西 南寧，530007) 2(黔南民族師范學(xué)院化學(xué)與化工系，貴州 都勻，558000)3(廣西大學(xué)商學(xué)院，廣西 南寧，530004)

近10 年來，以大型海藻作為第3 代生物質(zhì)能的源料用于生產(chǎn)生物燃料越來越受到重視。海帶是常見的大型海藻，我國海帶養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的70%［1］。海帶生長速度快，光合效率高，總生物質(zhì)產(chǎn)量高，碳水化合物占干重的50%以上，在乙醇發(fā)酵時不需要進行分離木質(zhì)素的預(yù)處理［2-3］。海帶碳水化合物成分主要有褐藻膠、褐藻糖膠、褐藻淀粉、甘露醇等。褐藻膠的主要成分是由α-L-古羅糖醛酸以及其C5 差向異構(gòu)體β-D-甘露糖醛酸通過隨機組合成的多聚體［4］。褐藻糖膠是類硫酸化雜多糖，主要由巖藻糖和硫酸基組成，并且還有少量的半乳糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸［5］。褐藻淀粉為線體聚合體，由β-(1→3)交聯(lián)葡萄糖殘基組成并含少量β-(1→6)交聯(lián)物作為中間或分支點殘基，以少量D-甘露醇作為末端基團［6］。海藻經(jīng)過物理、化學(xué)、生物等方法處理后，可以得到能被微生物轉(zhuǎn)化為乙醇的糖類物質(zhì)［7-10］。

本研究是以海帶為原料，經(jīng)過褐藻膠裂解酶和纖維素酶協(xié)同作用破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的甘露醇和海帶多糖溶出，利用酵母菌和發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵海帶水解液生產(chǎn)乙醇，為進一步深入研究大型海藻生物質(zhì)前處理以及乙醇發(fā)酵提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

海帶，購于市場，去除表面的泥沙和鹽分，烘干后粉碎過100 目篩。褐藻膠裂解酶，美國Sigma 公司;纖維素酶(1 萬U/g)，南寧龐博生物工程有限公司;實驗中所用其他試劑均為分析純。

1.2 菌種

棕櫚發(fā)酵細(xì)菌Zymobacter palmae(ATCC51623)、畢赤酵母Pichia angophorae (ATCC22304)，均購自美國菌株保藏中心(American Type Culture Collection)。

1.3 培養(yǎng)基

畢赤酵母種子培養(yǎng)基:甘露醇10 g/L，酵母浸粉3 g/L，麥芽浸粉0.3 g/L，蛋白胨5 g/L，pH 6.2。

棕櫚發(fā)酵細(xì)菌種子培養(yǎng)基:酵母提取物10.0 g/L，麥芽糖20.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，pH6.0。

海帶水解液制備:用適量褐藻膠裂解酶和纖維素酶糖化海帶后，過濾除去海帶渣，凍干濃縮水解液后甘露醇濃度為17.8 g/L，還原糖濃度為13.1 g/L，可用于發(fā)酵總糖成分濃度為30.9 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方:MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO42.5 g/L，(NH4)2SO45 g/L，酵母粉3 g/L，海帶水解液1 000 mL。

1.4 實驗方法

1.4.1 海帶酶糖化前的預(yù)處理

海帶的組成糖類復(fù)雜多樣，發(fā)酵前需水解，將多糖降解為能被微生物利用發(fā)酵產(chǎn)乙醇的單糖成分。

(1)采用酸提法對海帶粉中的甘露醇進行提取，通過對比甘露醇含量確定海帶粉粒徑。分別把20目、50 目、80 目、100 目的海帶粉5 g 加入100 mL 蒸餾水中，用0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH=2，65℃水浴1 h，離心取上清液，測定甘露醇含量。

(2)海帶中褐藻膠含量約占總碳水化合物的一半，褐藻膠極易與水結(jié)合生成黏性很大的膠體，為保證發(fā)酵的順利進行，需對海帶粉與水混合比例進行試驗探索。把海帶與水配置成濃度分別為2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15% (w/v)的混合溶液，加入0.1 mg/g 干海帶粉的褐藻膠裂解酶，在37℃恒溫?fù)u床，250 r/min 糖化24 h。

1.4.2 海帶酶解糖化實驗

1.4.2.1 褐藻膠裂解酶用量及水解時間

按褐藻膠裂解酶的最適溫度(37℃)與最適pH值(pH 6.3)，準(zhǔn)確稱量5.00 g 海帶粉分別與0.1 mol/L 檸檬酸納緩沖液100 mL(pH 6.3)混合于250 mL 三角瓶中中，分別加入不同劑量(0.04、0.08 0.12 0.16 0.2 mg/g 干海帶粉)的褐藻膠裂解酶，置于恒溫?fù)u床中37℃水解48 h，并在12、18、24、30、36 h 分別取樣;為使酶與底物充分接觸，所有酶解過程都是在恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速為250 r/min 條件下完成，每個條件做3 個平行重復(fù)。酶解后于12 000 p/min 離心10 min，用比色法測定甘露醇和還原糖含量。

1.4.2.2 纖維素酶用量及水解時間

在褐藻膠裂解酶水解徹底后，分別加入不同劑量(10、15、20、25、30 mg/g 干海帶粉)的纖維素酶，搖床溫度為50℃，用1 mol/L 檸檬酸調(diào)節(jié)pH 至5.0，繼續(xù)水解48 h。并在6、12、18、24、48 h 分別取樣，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，酶解后12 000 r/min 離心10 min，取上清液，用DNS 比色法測定還原糖濃度。

1.4.3 海帶經(jīng)不同提取方法效果對比實驗

本實驗采取用褐藻膠裂解酶、纖維素酶共同作用破壞海帶細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的糖類物質(zhì)更易溶出。

酸水解:海帶粉5 g(100 目)溶于100 mL 蒸餾水中，用0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 為2，置于65℃的水浴鍋中水解，分別在1、2、3 h 取樣，測定水解液中甘露醇和還原糖的含量。

酶水解:將海帶粉5 g(100 目)加入100 mL 蒸餾水，倒入250 mL 三角瓶中，同時加入褐藻膠裂解酶0.2 mg/g 和纖維素酶30 mg/g，置于37℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速250 r/min;由于2 種酶的最適酶解溫度不一樣，所以先在37℃下水解24 h，再于50℃水解24 h，分別在12、24、36、48 h 時取樣，測定甘露醇和還原糖含量。

1.5 海帶水解液發(fā)酵

將4℃冰箱保存的菌種挑取單菌落活化6 h 后接入種子培養(yǎng)基，恒溫?fù)u床中150 r/min、30℃培養(yǎng)24 h;發(fā)酵實驗在500 mL 三角瓶進行，裝液量300 mL、接種量6%、初始pH6.0、恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速150 r/min，32℃培養(yǎng)72 h，發(fā)酵期間為無菌條件，每隔12 h 取樣1 次，將樣品于12 000 r/min 離心5 min，取上清液保存于-20℃冰箱中以備后期分析。比色法測甘露醇消耗情況、DNS 測還原糖消耗情況。

1.6 分析方法

還原糖采用DNS 法測定［12］。甘露醇采用楊曉東等方法測定［13］。可溶性總糖采用苯酚-硫酸法測定［14］。乙醇采用氣相色譜法測定［15］。

2 結(jié)果與討論

2.1 海帶酶解前預(yù)處理對糖類溶出的影響

2.1.1 不同粒徑下甘露醇的溶出效果

海帶液中甘露醇的含量隨粒徑的減小在不斷增大，粒徑為100 目，甘露醇釋出量最高(圖1)，表明粒徑越小海帶中的糖類物質(zhì)越容易溶出。但80 ～100目甘露醇的溶出只增加不到7%，隨著粒徑的減小，海帶粉比表面積和吸水系數(shù)也增加，糖類物質(zhì)的浸出速度也隨著提高，但其過程所用能耗也越大，考慮成本和時間因素，在后續(xù)實驗中選用100 目的海帶粉進行發(fā)酵實驗。

圖1 不同海帶粒徑下甘露醇的溶出量Fig.1 The effect of different particle size on mannitol content by acidolysis

2.1.2 料液比對糖類溶出的影響

料液比對處理液的流動性有明顯的影響。海帶粉濃度(w/v)為12.5%和15%時，海帶粉將所有水吸收后，樣品還有部分成干粉狀態(tài)，無流動性，無法進行酸解或酶解處理;濃度為10%時，海帶粉雖然都與水充分結(jié)合，海帶顆粒呈飽滿狀態(tài)，但幾乎沒有流動的液體存在;濃度為7.5%，雖然有流動液體存在，但黏度太大，不適合后處理;2.5%和5%時，海帶液的黏度明顯下降。綜合每個濃度的黏性和酸解后可溶性糖含量，選擇濃度為5%進行酶解工藝實驗。

2.2 提取方法對可溶性糖溶出的影響

實驗發(fā)現(xiàn)苯酚硫酸法不能測定甘露醇，所以不必考慮當(dāng)苯酚硫酸法測可溶性總糖時，甘露醇的存在會影響總糖的測定。表3 結(jié)果顯示，酸處理后海帶水解液中的可溶性總糖、還原糖、甘露醇含量1 h 和3 h 相比增加量并不多。和Percival 文獻中的海藻酸處理方法一致，熱酸水解1 h 就已經(jīng)溶出大部分糖類。

表1 酸法處理水解液中甘露醇和還原糖的含量(占海帶干重)Table 1 Mannitol and reduced sugar content of the hydrolysate in different hours after acid treatment

在褐藻膠裂解酶和纖維素酶協(xié)同作用下，海帶液中各種糖類含量明顯高于酸法提取(表2)。水解24 h 時，甘露醇已經(jīng)溶出16.75%，即使再增加纖維素酶水解24 h 后也僅增加了不到1.5%，說明僅用褐藻膠裂解酶就可以使90%以上的甘露醇溶出。可溶性總糖和還原糖在12 h 和24 h 后時，兩者的含量都沒有明顯提高，然而加入纖維素酶后，36 h 和48 h 時測得兩者的含量較僅用褐藻膠裂解酶時，提高1.5 ～2 倍左右，纖維素酶可有效降解海帶中的纖維素或半纖維素，使其變?yōu)閱翁腔蛘叩途厶?。酶法比酸法可以溶出的糖類明顯增加，可溶性總糖提高了約52%左右，還原糖提高了將近70%，甘露醇較前兩者略有增加，只增加不到8%。兩種酶復(fù)合作用比用單一酶作用下得率更高，能夠獲得更高濃度的還原性糖，得到較多還原糖和甘露醇等單糖，更有利于乙醇發(fā)酵。

表2 酶法處理水解液中甘露醇和還原糖含量(占海帶干重)Table 2 Mannitol and reduced sugar content of the hydrolysate in different hours after enzyme treatment

2.3 酶水解條件確定

2.3.1 褐藻裂解酶用量及水解時間對糖類溶出影響

褐藻膠裂解酶用量對甘露醇溶出的影響見圖2。比較0.12 mg/g、0.16 mg/g、0.20 mg/g 的酶用量的產(chǎn)糖量，在30 h 后，三者甘露醇溶出量基本相等，但0.16 mg/g、0.20 mg/g 產(chǎn)糖含量在24 h 時，糖產(chǎn)量基本一樣，隨著時間的增加甘露醇含量也沒有大幅度的增加。因此，選擇酶用量為0.16 mg/g、水解24 h 作為后續(xù)實驗條件。

圖2 褐藻膠裂解酶用量和不同水解時間對海帶酶解產(chǎn)糖的影響Fig.2 Effect of alginate lyase enzyme loading and different time on mannitol yield of pretreated Laminaria japonica during enzymatic hydrolysis

2.3.2 纖維素酶用量及水解時間對糖類溶出的影響

前期預(yù)實驗時先用褐藻膠裂解酶降低海帶黏度，然后添加纖維素酶繼續(xù)水解，可以得到更高濃度的還原性糖，甘露醇含量在后期纖維素酶水解過程中基本就沒有增加，因此在選用纖維素酶用量時，只以還原糖含量為考察依據(jù)。圖3 結(jié)果顯示，纖維素酶用量越多，還原糖含量越高，酶解時間越短;酶用量為20 mg/g，酶解時間48 h 時，還原糖含量達(dá)到25 mg/g、30 mg/g 的原糖含量，基于成本和時間考慮，選擇用酶量為20 mg/g、水解24 h 作為后續(xù)實驗條件。

圖3 纖維素酶用量和水解不同時間對海帶酶解產(chǎn)糖的影響Fig.3 Effect of cellulase enzyme loading and different time on mannitol yield of pretreated Laminaria japonica during enzymatic hydrolysis

2.4 酶解液的乙醇發(fā)酵

圖4 是畢赤酵母以海帶雙酶水解液為底物，利用水解液中甘露醇、還原糖產(chǎn)乙醇的結(jié)果。圖4 結(jié)果顯示乙醇濃度隨著，發(fā)酵液中甘露糖和還原糖的消耗呈現(xiàn)逐步增加的趨勢;在12 h 時畢赤酵母以利用還原糖為主，還原糖濃度由13.1 g/L 減少到5.37 g/L，甘露醇濃度由17.8 g/L 降為16.94 g/L，只減少不到1 g/L，此時沒有測到乙醇，這一過程以酵母細(xì)胞增長為主，還未進入?yún)捬醢l(fā)酵產(chǎn)乙醇階段;在24 h 時，還原糖濃度降為2.73 g/L，甘露醇濃度急劇下降到7.73 g/L，乙醇濃度為1.65 g/L。從36 h 至發(fā)酵結(jié)束，還原糖濃度基本維持在一個相對穩(wěn)定狀態(tài)，這部分糖可能是不能被畢赤酵母利用的成分;36 ～48 h，甘露醇濃度由3.17 g/L 降為0，乙醇濃度從3.79 g/L 增長到最大值4.57 g/L;之后乙醇濃度有所下降;發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液pH 從6.0 降為2.96，說明在發(fā)酵過程，除乙醇外，還有有機酸等其它產(chǎn)物產(chǎn)生，造成發(fā)酵液pH 下降，按乙醇濃度最高達(dá)到4.57 g/L 計，乙醇轉(zhuǎn)化率為0.161 g/g 糖，達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的28.99%。

圖4 畢赤酵母利用海帶水解液發(fā)酵乙醇Fig.4 Ethanol production from Laminaria japonica by Pichia angophorae ATCC22304

圖5 是海洋細(xì)菌Z . palmae 以海帶水解液為底物發(fā)酵產(chǎn)乙醇及糖類消耗趨勢。結(jié)果顯示，發(fā)酵液發(fā)酵過程中，乙醇濃度呈緩慢增加趨勢，0 ～24 h 時，甘露醇和還原糖濃度同步緩慢下降，分別由17.80 g/L、13.10 g/L 降至14.72 g/L、11.36 g/L;底物利用較緩慢，乙醇產(chǎn)量低，僅為0.94 g/L，說明在發(fā)酵初期階段，碳源只是維持發(fā)酵菌的生長與增殖。24 h ～48 h，甘露醇和還原糖濃度分別急速下降到3.82 g/L 和7.35 g/L，乙醇濃度也出現(xiàn)較大幅度增長，由0.94 g/L 增到2.05 g/L，說明糖的消耗速率與乙醇生產(chǎn)速率基本一致;糖類物質(zhì)消耗越快，乙醇生成的速率也越快。這一階段細(xì)胞個數(shù)達(dá)到一定峰值后，開始進入?yún)捬醢l(fā)酵階段，乙醇產(chǎn)量開始增加。從還原糖濃度消耗情況看出，在48 h 后，還原糖基本維持一個水平不再下降，表明Z. palmae 不能利用剩余的還原糖。60 h時甘露醇完全耗盡，乙醇濃度達(dá)到最大值2.68 g/L，相應(yīng)乙醇轉(zhuǎn)化率為0.114 g/g 糖。

圖5 棕櫚發(fā)酵細(xì)菌利用海帶水解液發(fā)酵乙醇Fig.5 Ethanol production from Laminaria japonica by Zymobacter palmae ATCC51623

發(fā)酵結(jié)束后，測得發(fā)酵液酸度由pH6.0 降為pH3.35，發(fā)酵過程中生成大量有機酸使其酸度降低，pH 過低影響細(xì)菌正常代謝過程。因此，后續(xù)工作實驗需要發(fā)酵細(xì)菌全程參數(shù)調(diào)控優(yōu)化，以便提高海帶發(fā)酵效率，同時用HPLC 檢測發(fā)酵產(chǎn)物及副產(chǎn)物成分。

3 結(jié)論

(1)海帶中多糖類物質(zhì)在酸和高溫環(huán)境下，可以被降解為單糖或低聚糖;但同時六碳糖醇(甘露醇)及水解后的其他單糖，在高溫酸的環(huán)境下加劇脫水生成副產(chǎn)物羥甲基糠醛(5-HMF)、乙酰丙酸、甲酸等物質(zhì)，它們的存在會抑制微生物的生長，影響后期發(fā)酵乙醇產(chǎn)量。酶法水解較溫和，不會有這些副產(chǎn)物產(chǎn)生，先通過褐藻膠裂解酶水解，再向酶解體系中補加纖維素酶，從而彌補酶解體系的不足，提高了酶解得率。以海帶粉濃度為5%(w/v)進行酶解實驗，在酶解條件分別為:①溫度37℃、pH6.3、酶用量0.16 mg褐藻膠裂解酶/g 干海帶粉、水解時間24 h，②溫度50℃、pH5.0、酶用量20 mg 纖維素酶/g 干海帶粉，水解24 h;通過雙酶解，可以得到甘露醇17.8%、還原糖12.9%、可溶性總糖20.2%(占藻體干重的百分比)。酶法和酸法得到總糖(可溶性總糖和甘露醇之和)分別約占藻體干重的38%和29.84%，酶法比酸法提取的糖類提高了27.4%。

(2)海帶酶解液經(jīng)過濃縮后，利用畢赤酵母、棕櫚發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵，最高乙醇濃度分別為分別4.57 g/L(5.8 mL/L)和2.68 g/L(3.4 mL/L)，最大乙醇濃度達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的28.99%;由前期實驗結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，P. angophorae 可以直接利用甘露醇、巖藻糖、甘露糖、木糖、葡萄糖等單糖，以及褐藻糖膠、昆布多糖等多糖為唯一碳源發(fā)酵生產(chǎn)乙醇;Z. palmae 可以利用甘露醇、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、昆布淀粉為碳源發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，但都不能利用海帶的主要成分褐藻膠產(chǎn)乙醇。畢赤酵母與棕櫚發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵海帶水解液產(chǎn)乙醇的結(jié)果不夠理想，主要有以下幾點影響因素:海帶中含有碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、色素、金屬離子、碘等較為復(fù)雜，通過水解后海帶液中糖類物質(zhì)復(fù)雜多樣，主要成分不能被微生物所利用，還有沒有對海帶中金屬離子、碘等因素進行研究，是否會影響菌株的發(fā)酵結(jié)果等;發(fā)酵是一個復(fù)雜的生化過程，其結(jié)果好壞涉及諸多因素，除了菌株的生產(chǎn)性能，還與培養(yǎng)基的配比、種子質(zhì)量、發(fā)酵條件和控制過程等因素有密切關(guān)系，由于本次實驗是在搖瓶中進行，發(fā)酵實驗結(jié)果不夠理想，后期研究工作應(yīng)該用發(fā)酵罐優(yōu)化發(fā)酵工藝條件來提高乙醇產(chǎn)率。

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