張夢(mèng)茹，劉美蓉，朱娜麗，全明明，張寶善

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

豆渣是大豆產(chǎn)品加工過(guò)程中的副產(chǎn)品，約占全豆的15% ～20%。其營(yíng)養(yǎng)成分高于眾多槽渣，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、異黃酮、B 族維生素以及鈣、鐵、鋅、鉀等多種微量元素。研究表明，每100 g干豆渣中含有水分8.31 g，蛋白質(zhì)19.32 g，脂肪12.40 g，纖維素51.8 g，灰分3.54 g［1-2］，是典型的低熱能高植物蛋白的食品資源，更是一種很重要的天然膳食纖維資源。但是豆渣的能量含量低、含水量較高、保質(zhì)期短等特性使其再利用受到一定限制。在我國(guó)，傳統(tǒng)利用方式是將豆渣作為飼料，直接喂養(yǎng)動(dòng)物;在日本，大量的豆渣被焚燒掉;在香港，豆渣通常作為廢棄物堆放。這樣不僅使其營(yíng)養(yǎng)成分大量流失，同時(shí)也造成了環(huán)境污染。因此，如何更好地利用豆渣成為急需研究和解決的問(wèn)題。

因此，本實(shí)驗(yàn)以豆渣代替豆粕為原料，發(fā)酵生產(chǎn)我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品醬油。傳統(tǒng)的醬油是采用低鹽固態(tài)發(fā)酵法以大豆為原料，經(jīng)過(guò)熬制、發(fā)酵、淋取等工藝制成。其原料昂貴，且發(fā)酵曲種單一，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解不足，利用率較低。近年來(lái)，多采用多菌種制曲發(fā)酵工藝，如利用米曲霉和黑曲霉混合制曲，彌補(bǔ)因單一菌種釀造醬油而使蛋白質(zhì)分解不足的缺陷。原料處理方面，對(duì)原料進(jìn)行酶解處理，采用纖維素酶［3］，破壞原料細(xì)胞壁，釋放出蛋白質(zhì)和淀粉，利于發(fā)酵進(jìn)行，同時(shí)還可以起到增加色度并提高還原糖的作用。本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)低鹽固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上，采用米曲霉與黑曲霉雙菌混合發(fā)酵生產(chǎn)醬油，可望擴(kuò)充醬油的生產(chǎn)原料來(lái)源，并提高豆渣的利用率。

研究證實(shí)，原料配比、菌種配比、高壓蒸煮時(shí)間、鹽水濃度和冷熱殺菌對(duì)成品品質(zhì)都有不同程度的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)這5 個(gè)因素進(jìn)行探究?jī)?yōu)化，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，最終得到豆渣發(fā)酵生產(chǎn)醬油的最佳工藝參數(shù)，并且對(duì) 成品進(jìn)行感官、理化和衛(wèi)生指標(biāo)的檢驗(yàn)分析。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

黃豆豆渣:自制豆渣;麥麩;豆粕;市售食鹽

發(fā)酵菌種:米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)，來(lái)自于陜西師范大學(xué)食品發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 設(shè)備

LX-B50L 不銹鋼蒸汽消毒器，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;GHX-9080B-1 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司;JY301 型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;GZX-914MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ 型超凈工作臺(tái)，上海雷鈞試驗(yàn)儀器制造有限公司;PHS-3C 型精密PH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;Kjeltec 2300 全自動(dòng)凱氏定氮儀，瑞典福斯公司;JTMX-LHS-100SC 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 菌種的制備

將米曲霉(黑曲霉)接入斜面試管上，控制培養(yǎng)溫度為30℃，恒溫培養(yǎng)48 h 至長(zhǎng)滿厚密的黃綠色孢子(褐黑色孢子);再將培養(yǎng)好的斜面菌種接入三角瓶中培養(yǎng)，搖勻，控制培養(yǎng)溫度為30℃，恒溫培養(yǎng)20 h，瓶?jī)?nèi)麩皮曲料發(fā)白結(jié)餅，搖瓶一次，搖碎結(jié)塊，再過(guò)4 h 再搖瓶1 次，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，整個(gè)麩皮曲料全部變?yōu)辄S綠色(黑色)，三角瓶中已培養(yǎng)好。

1.2.2.2 制曲

將所需原料按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配比混合均勻，按照原料干基∶水(m∶m)=1∶2 潤(rùn)水后于121℃下滅菌，冷卻至30℃左右，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別接種米曲霉和黑曲霉，30 ～32℃［4-5］分別制曲36h［6］。

1.2.2.3 混合發(fā)酵

將成曲混合均勻后按照干料∶食鹽水(m∶m)=1∶2.5 加入進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，浸出濾油，分別評(píng)價(jià)醬油的感官特性，測(cè)定全氮含量、氨基酸態(tài)氮、可溶性無(wú)鹽固形物含量。

1.3 豆渣發(fā)酵醬油工藝參數(shù)的確定

1.3.1 原料配比對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

選取豆渣和麩皮，將其按照不同比例分為4 組:

(1)豆渣∶麩皮=8 ∶2;(2)豆渣∶麩皮=7 ∶3;(3)豆渣∶麩皮=6∶4;(4)豆渣∶麩皮=5∶5

1.3.2 菌種配比對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

采用米曲霉與黑曲霉接種量4∶1 混合、米曲霉與黑曲霉接種量3∶1 混合、米曲霉與黑曲霉接種量1∶1、米曲霉與黑曲霉接種量1∶3 混合混合這4 種方式進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.3 高壓蒸煮時(shí)間對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

選取高壓蒸煮時(shí)間為20、30、40、50 min 進(jìn)行研究。

1.3.4 鹽水濃度對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

選取鹽水濃度分別為6%、8%、10%、12%對(duì)其進(jìn)行研究。

1.3.5 冷殺菌與熱殺菌對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

采用冷殺菌技術(shù)(超聲波殺菌、微波殺菌)對(duì)醬油滅菌，并與傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)比較，檢測(cè)成品醬油的穩(wěn)定性，確定最佳殺菌方法和工藝參數(shù)。

1.3.6 豆渣發(fā)酵醬油工藝參數(shù)的優(yōu)化

參考以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9(43)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 發(fā)酵過(guò)程中醬油全氮含量變化的測(cè)定

從制曲開(kāi)始到發(fā)酵結(jié)束整個(gè)過(guò)程中，隔天取樣。用全自動(dòng)凱氏定氮儀對(duì)樣品中的全氮含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 發(fā)酵過(guò)程中醬油氨基酸態(tài)氮含量變化的測(cè)定

從制曲開(kāi)始到發(fā)酵結(jié)束整個(gè)過(guò)程中，隔天取樣。按照GB/T 5009139 -2003 中甲醛值法對(duì)樣品中的氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 發(fā)酵過(guò)程中醬油可溶性無(wú)鹽固形物含量測(cè)定

醬油中總固形物含量減去NaCl 含量即為可溶性無(wú)鹽固形物含量。NaCl 含量的測(cè)定采用GB/T 5009139 -2003。

1.4.4 感官特性評(píng)定方法

根據(jù)《GB 18186 -2000 釀造醬油》，結(jié)合豆渣發(fā)酵醬油自身的特點(diǎn)，以色澤、香氣、滋味和體態(tài)這四項(xiàng)作為指標(biāo)，每項(xiàng)25 分，總分100 分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1 所示。

表1 豆渣發(fā)酵醬油的感官特性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The sense evaluation standard of Fermenting soy sauce using bean dregs

1.4.5 理化特性評(píng)定方法

根據(jù)《GB 18186 -2000 釀造醬油》，結(jié)合豆渣發(fā)酵醬油自身的特點(diǎn)，以可溶性無(wú)鹽固形物、全氮含量、氨基酸態(tài)氮含量這3 項(xiàng)作為指標(biāo)。具體標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 豆渣發(fā)酵醬油的理化指標(biāo)Table 2 The physical and chemical index of fermenting soy sauce using bean dregs

1.4.6 衛(wèi)生指標(biāo)評(píng)定方法

我國(guó)醬油的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過(guò)了1996 年、1981 年、2003 年的多次修訂，目前按《GB 2717 -2003 醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》執(zhí)行。具體的微生物指標(biāo)見(jiàn)表3。

表3 豆渣發(fā)酵醬油的微生物指標(biāo)Table 3 The microbiological indicator fermenting soy sauce using bean dregs

2 結(jié)果與分析

2.1 原料配比對(duì)豆渣發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

原料配比是影響豆渣發(fā)酵醬油品質(zhì)的一個(gè)重要因素。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，選擇豆渣四個(gè)不同水平的添加量對(duì)制曲物料配比做進(jìn)一步優(yōu)化。豆渣發(fā)酵醬油的最佳接種量為干料量的0.1% ～0.3%，保持培養(yǎng)溫度28 ～30℃制曲，在成曲中按1∶2 加入食鹽水，45℃培養(yǎng)發(fā)酵。

表4 原料配比對(duì)豆渣發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響Table 4 The effect of ratio of raw materials on fermenting soy sauce using bean dregs

由表4 可知，當(dāng)原料配比為m(豆渣)∶m(麩皮)=6∶4 時(shí)，醬油中全氮含量、氨基酸態(tài)氮含量、可溶性無(wú)鹽固形物含量及感官評(píng)定均優(yōu)于其他組。原料配比按m(豆渣)∶m(麩皮)=7∶3 發(fā)酵制成的醬油理化指標(biāo)均高于原料比為5∶5，但是感官評(píng)定略低于原料比為5∶5。因此，當(dāng)原料配比在7∶3 與6∶4 之間時(shí)，豆渣發(fā)酵醬油的品質(zhì)最佳。

2.2 菌種配比對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

米曲霉產(chǎn)生中性蛋白酶的能力比較強(qiáng)［7-8］，生成酸性蛋白酶的能力較弱，而醬油的發(fā)酵過(guò)程一般都處于偏酸條件下，這就對(duì)蛋白質(zhì)的分解利用造成一定困難，而黑曲霉不但能產(chǎn)生較多的酸性蛋白酶，而且能產(chǎn)生米曲霉不能產(chǎn)生的纖維素酶、柚甘酶等多種酶。所以利用米曲霉和黑曲霉混合制曲，能夠彌補(bǔ)單一米曲霉釀造醬油酸性蛋白酶活力太弱的不足，使醬醅中各種酶的比例更趨合理，從而提高氨基酸的生成率，原料的全氮利用率和出品率［9］。所以本實(shí)驗(yàn)采用混合菌種制曲。在雙菌制曲中，適宜的菌種配比對(duì)醬油的品質(zhì)有很大的影響。在上述2.1 的恒定條件下，豆渣與麩皮質(zhì)量比6∶4 混合，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取米曲霉和黑曲霉比例分別為4∶1 ，3∶1 ，1∶1 ，1∶3對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化研究。

由表5 顯示，隨著米曲霉所占比例的增大，全氮含量、氨基酸態(tài)氮含量、可溶性固形物含量、感官評(píng)分均增大。當(dāng)米曲霉與黑曲霉按4∶1 混合時(shí)，醬油的氨基酸態(tài)氮和可溶性固形物含量最高，當(dāng)米曲霉與黑曲霉按3∶1 混合時(shí)，醬油中的全氮含量最高。當(dāng)米曲霉和黑曲霉質(zhì)量比為1∶3 時(shí)，雖然提高了氨基酸生成率，但會(huì)影響全氮的利用率，并且4 項(xiàng)指標(biāo)均低于其他組。所以黑曲霉的用量不能過(guò)多，要以米曲霉為主要發(fā)酵菌種。故豆渣發(fā)酵醬油的最佳菌種配比介于3∶1 和4∶1 之間。

表5 菌種配比對(duì)醬油品質(zhì)的影響Table 5 The effect of proportion of different bacteria on fermenting soy sauce using bean dregs

2.3 高壓蒸煮時(shí)間對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

按原料m(原料干基)∶m(水)=1∶2.5 潤(rùn)水，在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行高溫蒸煮(固定蒸煮溫度為121℃，蒸煮時(shí)間設(shè)定4 個(gè)考察點(diǎn):20 、30 、40 、50 min)、接種、發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6 所示。

表6 高壓蒸煮時(shí)間對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響Table 6 The effect of high pressure cooking time on fermenting soy sauce using bean dregs

蒸煮的主要目的是使原料中蛋白質(zhì)分子發(fā)生適度變性，露出蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的氨基酸支鏈，使其容易進(jìn)行酶水解，同時(shí)達(dá)到殺菌的目的。如果蒸煮時(shí)間、溫度不足，蛋白質(zhì)分子未達(dá)到一次變性，會(huì)產(chǎn)生曲霉蛋白酶不能分解的N 性物質(zhì)。在高溫、長(zhǎng)時(shí)間蒸煮后，一方面，蛋白質(zhì)分子會(huì)發(fā)生過(guò)度變性，不能為曲霉蛋白酶所分解;另一方面，蛋白質(zhì)分子會(huì)與糖分子發(fā)生褐變反應(yīng)，從而降低氮的利用率，損失一部分氨基酸［10］。

由表6 可知，當(dāng)蒸煮時(shí)間小于30 min 時(shí)，理化指標(biāo)和感官評(píng)定隨著時(shí)間延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)高壓蒸煮時(shí)間大于30 min 時(shí)理化指標(biāo)和感官評(píng)定隨著時(shí)間延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)。因此，豆渣發(fā)酵醬油原料的最佳蒸煮時(shí)間為30 min 左右。

2.4 鹽水濃度對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

在豆渣發(fā)酵醬油過(guò)程中，向成曲中拌入鹽水的主要作用是防止發(fā)酵過(guò)程醬醅被雜菌污染，但過(guò)高的鹽水濃度會(huì)抑制蛋白酶的作用，使得發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)［11-12］。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取濃度分別為6%、8%、10%、12%、14%的鹽水對(duì)醬醅進(jìn)行發(fā)酵。對(duì)發(fā)酵過(guò)程中樣品的理化指標(biāo)和感官評(píng)定測(cè)定如表7 所示。

表7 鹽水濃度對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響Table 7 The effect of brine concentration on fermenting soy sauce using bean dregs

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽水濃度低于8%時(shí)仍有雜菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致醬油色澤暗淡，醬香味不濃，略有異味。但當(dāng)鹽水濃度高于12%時(shí)，又會(huì)抑制酶的活性，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，降低原料中氮的利用率，同時(shí)由于抑制產(chǎn)香有益菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其香味很淡，從而影響醬油的質(zhì)量。由表2 ～表4 可知，鹽水濃度為12%時(shí)醬油中全氮含量最高，在該鹽水濃度下成曲中蛋白質(zhì)分解最好，氨基酸態(tài)氮形成也最高，但可溶性無(wú)鹽固形物含量稍低。故豆渣發(fā)酵醬油的最佳鹽水濃度為12%左右。

2.5 冷殺菌與熱殺菌對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

醬油生產(chǎn)中傳統(tǒng)的殺菌和抑菌技術(shù)主要是采用熱殺菌和添加防腐劑的方法［13］。但是這2 種殺菌方法也有很多不足的地方，熱殺菌容易導(dǎo)致醬油中熱敏營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，例如氨基酸和一些香氣成分，使醬油顏色褐變嚴(yán)重，不容易控制醬油的色澤，也會(huì)使有害副產(chǎn)物增多，以及具有能耗大等缺點(diǎn)。添加防腐劑容易給醬油帶來(lái)食品安全危害。而冷殺菌技術(shù)是具有能殺死微生物，對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)、質(zhì)構(gòu)、色澤和風(fēng)味影響較小的殺菌技術(shù)［14］。

設(shè)置4 組實(shí)驗(yàn)，采用冷殺菌技術(shù)(超聲波殺菌、微波殺菌)對(duì)醬油滅菌，并與傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)比較，檢測(cè)成品醬油的穩(wěn)定性，確定最佳殺菌方法和工藝參數(shù)。1 號(hào)不做任何處理，作為空白對(duì)照;2 號(hào)組為超聲波殺菌，頻率為20 kHz，滅菌時(shí)間為20 min，當(dāng)殺菌時(shí)間累計(jì)達(dá)到4 min 時(shí)，所滅菌的醬油微生物菌落總數(shù)達(dá)到了合格指標(biāo);3 號(hào)組為微波殺菌，在37℃實(shí)驗(yàn)溫度下，微波輸出功率為720 W，樣品厚度20 cm，微波處理時(shí)間4 min，所滅菌的醬油微生物菌落總數(shù)達(dá)到了合格指標(biāo);4 號(hào)組為超高溫瞬時(shí)滅菌，135℃殺菌5 s，所滅菌的醬油微生物菌落總數(shù)達(dá)到了合格指標(biāo)。

原料配比為豆渣∶麩皮=6∶4，菌種配比米曲霉∶黑曲霉=4∶1，發(fā)酵溫度為45℃，鹽水濃度為12%，蒸煮時(shí)間為30 min。發(fā)酵結(jié)果如下表:

表8 殺菌方法對(duì)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響Table 8 The effect of sterilization methods on fermenting soy sauce using bean dregs

從表8 可看出，超聲波殺菌和微波殺菌與超高溫瞬時(shí)滅菌相比，對(duì)醬油的香氣成分的破壞較小、氨基酸損失較少，護(hù)色效果好。但高溫殺菌滅菌徹底，保鮮期長(zhǎng)，彌補(bǔ)冷殺菌方法滅菌不徹底，保鮮期不長(zhǎng)的缺點(diǎn)。因此采用冷殺菌與熱殺菌相結(jié)合的滅菌方法對(duì)醬油進(jìn)行滅菌處理。

2.6 豆渣發(fā)酵醬油工藝參數(shù)的優(yōu)化

為了確定豆渣發(fā)酵醬油最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)，在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以原料配比、菌種配比、高壓蒸煮時(shí)間和鹽水濃度為試驗(yàn)因素，感官評(píng)定為指標(biāo)，采用L9(43)正交表(表9)進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表9。

表9 豆渣發(fā)酵醬油正交試驗(yàn)因素水平表Table 9 The factors and levels of fermenting soy sauce using bean dregs

表10 豆渣發(fā)酵醬油工藝參數(shù)確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Table 10 The result of fermenting soy sauce using bean dregs’technology parameter and analysis of rang

3 結(jié)論

(1)麩皮添加量的多少影響醬油的色澤和鮮味，當(dāng)豆渣與麩皮質(zhì)量比為6∶4 時(shí)，成品醬油氨基酸態(tài)氮含量高，醬油有光澤，醬香味濃郁。

(2)利用米曲霉和黑曲霉混合制曲，能夠彌補(bǔ)單一米曲霉釀造醬油酸性蛋白酶活力太弱的不足，當(dāng)米曲霉與黑曲霉接種比例為4∶1 時(shí)，蛋白酶活力強(qiáng)，原料全氮利用率高，氨基酸生成率高。

(3)當(dāng)蒸煮時(shí)間為30 min 時(shí)，原料中蛋白質(zhì)分子發(fā)生適度變性，露出蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的氨基酸支鏈，使蛋白質(zhì)容易進(jìn)行酶水解，同時(shí)達(dá)到殺菌的目的。醬油品質(zhì)較高。

(4)鹽水濃度為12%時(shí)醬油中全氮含量最高，在該鹽水濃度下成曲中蛋白酶活力強(qiáng)，蛋白質(zhì)分解最好，氨基酸態(tài)氮形成也最高。

(5)冷殺菌與熱殺菌相比，對(duì)醬油的香氣成分破壞較小、氨基酸損失少，護(hù)色效果好。但高溫滅菌徹底，保鮮期長(zhǎng)，彌補(bǔ)冷殺菌方法滅菌不徹底，保鮮期不長(zhǎng)的缺點(diǎn)，因此建議將冷殺菌作為醬油的輔助消毒或協(xié)同滅菌，冷熱殺菌相結(jié)合的滅菌方法對(duì)將有進(jìn)行滅菌。

(6)通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵豆渣醬油的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定豆渣醬油的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明，制曲原料配比為豆渣∶麩皮=6∶4，原料干基∶水(m∶m)= 1∶2.5 潤(rùn)水;最佳發(fā)酵條件為米曲霉∶黑曲霉(m∶m)=4∶1，發(fā)酵溫度45℃，鹽水濃度12%，發(fā)酵時(shí)間為15 d。成品達(dá)到了《GB18186 -2000 釀造醬油》低鹽固態(tài)發(fā)酵法二級(jí)醬油的標(biāo)準(zhǔn)。

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