李利華

(陜西理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中，723000)

大蒜中含有芹菜定、異鼠李黃素、山奈酚、槲皮素等6 種黃酮類化合物(flavonoids)［1］。黃酮類化合物又名生物類黃酮，屬植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于蔬菜、水果及谷物中，具有抗菌、抗病毒、消炎、抗過(guò)敏、擴(kuò)張血管等多種生理功能，還具有很好的清除自由基、抗氧化活性［2-4］。本研究采用超聲波輔助乙醇提取大蒜中的黃酮類化合物，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化;并以體外抗氧化體系為模型，研究其對(duì)羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紫皮大蒜，購(gòu)于漢中蔬菜批發(fā)市場(chǎng)，將大蒜剝皮、洗凈、切片，50 ℃干燥至恒重，研成細(xì)粉末備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)、無(wú)水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、鄰二氮菲、雙氧水、FeSO4、Vc、三羥甲基氨基甲烷等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

KQ-700VDE 型三頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;UV 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司;RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;TDL-5-A 低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科技儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜總黃酮超聲輔助提取工藝

準(zhǔn)確稱取大蒜干粉樣品2.0 g 若干份，固定超聲功率為350 W，分別在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間、料液比條件下提取大蒜黃酮，收集濾液，以石油醚脫脂除色，濃縮并定容于50 mL 容量瓶中，即得大蒜總黃酮提取液。

1.2.2 大蒜總黃酮含量測(cè)定及提取率計(jì)算

以蘆丁為對(duì)照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法［9］制做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定大蒜中總黃酮含量。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A = 0.941 5 c + 0.014 4，R =0.999 2，蘆丁濃度(c)在0.01 ～0.12 mg/mL 內(nèi)與吸光度(A)有良好的線性關(guān)系。

樣品含量測(cè)定:精密移取大蒜總黃酮提取液1.0 mL 于10 mL 比色管中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻并放置6 min;加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻并放置6 min;再加入4%NaOH 溶液3 mL，用蒸餾水稀釋并定容至刻度，搖勻并放置15 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮含量及提取率:

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%，50%，60%，70%，80%)、超聲提取溫度(30，40，50，60，70 ℃)、超聲提取時(shí)間(30，40，50，60，70 min)和料液比(1 ∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60)對(duì)大蒜總黃酮提取效果的影響，初步確定適宜提取大蒜總黃酮的相應(yīng)水平范圍。每個(gè)處理做3 個(gè)平行。

1.2.4 最佳工藝條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間及料液比作為4 個(gè)考察因素，選取3 個(gè)水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化大蒜總黃酮超聲輔助提取的最佳工藝條件。

1.2.5 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1 對(duì)羥自由基(·OH)清除作用的測(cè)定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法［6］。10 mL 具塞試管中依次加入5 mmol/L 的鄰二氮菲1 mL，pH 7.4 的PBS 緩沖溶液3.8 mL，不同濃度的大蒜總黃酮提取液1.0 mL，5.0 mmol/L 的FeSO41.5 mL 及0.1%H2O21.0 mL，于37℃水浴保溫60 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)536 nm 處吸光度A樣品，用蒸餾水代替大蒜總黃酮提取液測(cè)定吸光度A損傷，用蒸餾水代替大蒜總黃酮提取液和0.1%H2O2測(cè)定吸光度A未損。以Vc 做陽(yáng)性對(duì)照。平行測(cè)定3 次?！H 清除率/% =［(A樣品-A損傷)/(A未損-A損傷)］×100

1.2.5.2 對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)清除作用的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法［7］。10 mL 具塞試管依次加入0.05 mol/L pH 8.2 的Tris-HCl 緩沖溶液6 mL，不同濃度的大蒜總黃酮提取液1 mL，再加入25℃水浴中預(yù)熱的鄰苯三酚1 mL，搖勻后立即置于25℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，滴加8 mol/L 的HCl 2 滴終止反應(yīng)，測(cè)320 nm 處吸光度A樣品，用蒸餾水代替大蒜總黃酮提取液測(cè)定吸光度A空白。以同濃度Vc 做陽(yáng)性對(duì)照，平行測(cè)定3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

由圖1 可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)40% ～80%內(nèi)，總黃酮提取率先隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而明顯增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)到最高值，后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而下降。這是由于黃酮是一大類物質(zhì)，因極性和化學(xué)性質(zhì)的不同導(dǎo)致部分水溶部分醇溶，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，醇溶性和水溶性黃酮類物質(zhì)都能最大程度地溶出。故選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.1.2 超聲提取溫度對(duì)提取率的影響

由圖2 可知，在30 ～70 ℃，隨著超聲提取溫度的升高，總黃酮提取率逐漸增大，在60 ℃提取率達(dá)最大值，繼續(xù)升高溫度，提取率有所降低。這是由于溫度過(guò)高，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，從而導(dǎo)致提取率下降。故選取超聲提取溫度60 ℃。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect ofethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

圖2 超聲提取溫度對(duì)大蒜總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of total flavonoids

2.1.3 超聲提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖3 可知，在30 ～70 min 內(nèi)，總黃酮提取率隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，在50 min 時(shí)提取率達(dá)最大值，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲提取時(shí)間，提取率反而下降。這是由于長(zhǎng)時(shí)間超聲波處理，非黃酮類物質(zhì)溶出增加和提取的黃酮發(fā)生分解，且時(shí)間越長(zhǎng)耗能越多。故超聲時(shí)間應(yīng)控制在50 min 為宜。

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)大蒜總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonicduration on extraction yield of total flavonoids

2.1.4 料液比對(duì)提取率的影響

由圖4 可知，當(dāng)料液比為1∶30(g∶mL)時(shí)，總黃酮提取率最高，料液比低于1∶30 時(shí)提取不完全，高于1∶30 時(shí)提取率略呈下降趨勢(shì)。這是由于料液比為1∶30時(shí)，溶劑對(duì)黃酮的溶解已基本達(dá)到飽和，繼續(xù)增加溶劑用量，并不能提高其提取率。故料液比應(yīng)控制在1∶30 為宜。

圖4 料液比對(duì)大蒜總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect ofratio of material to liquid on extraction yield of total flavonoids

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取的正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，按表1 的正交因素水平設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)正交助手軟件方差統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表2 和表3。

由表2 極差分析可知，各因素對(duì)大蒜總黃酮的提取率都有不同程度的影響，各因素對(duì)提取率影響的主次順序?yàn)?A(乙醇體積分?jǐn)?shù))＞B(超聲溫度)＞C(超聲時(shí)間)＞D(料液比)，優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件為A2B2C3D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲溫度60℃，超聲時(shí)間60 min，料液比1∶30。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels for the L9(34)orthogonal design

由于D (料液比)對(duì)提取率影響最小，故其在方差分析表中作為誤差項(xiàng)。由表3 可知，4 因素中，A(乙醇體積分?jǐn)?shù))對(duì)總黃酮的提取率有顯著性影響。

2.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

分別稱取5 份大蒜干粉樣品，在優(yōu)化得到的最佳工藝條件(A2B2C3D2)下按照1.2.1 提取大蒜總黃酮并計(jì)算提取率，測(cè)得總黃酮平均提取率為4.213%，RSD 為1.67%，表明該工藝條件穩(wěn)定可行，為大蒜總黃酮超聲輔助提取的最佳工藝條件。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析(n=3)Table 2 Orthogonal array design and results for optimization of the total flavonoids extract (n=3)

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.4 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 對(duì)羥自由基(·OH)清除作用

由圖5 看出，隨著大蒜總黃酮濃度的增加，其對(duì)·OH 的清除率也逐漸增大，且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，在試驗(yàn)范圍內(nèi)的最大清除率為77.56%，對(duì)比Vc 可看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，大蒜總黃酮提取液對(duì)·OH 的清除能力強(qiáng)于同濃度的Vc，說(shuō)明大蒜總黃酮是一種有效的·OH 清除劑。

2.4.2 對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)清除作用

由圖6 可知，大蒜總黃酮濃度愈高，對(duì)O2-·的清除作用愈強(qiáng)，在試驗(yàn)范圍最大清除率達(dá)87.87%，與Vc 比較可見(jiàn)，試驗(yàn)范圍內(nèi)Vc 對(duì)O2-·的最大清除率為95.92%，由此表明大蒜總黃酮對(duì)O2-·具有一定的清除作用，清除能力略低于Vc。

3 結(jié)論

圖5 大蒜總黃酮對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用Fig.5 Scavenging effect of the total flavonoids extract from garlic on ·OH

圖6 大蒜總黃酮對(duì)超氧自由基(O2-·)的清除作用Fig.6 Scavenging effect of the total flavonoids extract from garlic on O2-·

(1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜總黃酮提取率具有顯著性影響，各因素對(duì)提取率影響的主次順序?yàn)?乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲提取溫度＞超聲提取時(shí)間＞料液比。大蒜總黃酮最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間60 min，料液比1∶30，在此工藝條件下，大蒜總黃酮的提取率為4.213%。

(2)以Vc 為陽(yáng)性對(duì)照品，研究了大蒜總黃酮的體外抗氧化能力。結(jié)果表明，大蒜總黃酮具有一定的清除·OH 和O2-·能力，在一定范圍內(nèi)，清除效果隨添加量的升高而加強(qiáng)，且具有明顯的量效關(guān)系，對(duì)·OH 的清除效果要優(yōu)于同濃度的Vc，而對(duì)O2-·的清除效果略低于Vc。

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