崔鵬飛，鄧國華，韋良孟，焦培榮＊，廖 明＊

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室

農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱150001）

干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）是干擾素調(diào)節(jié)因子家族的成員之一，在Ⅰ型干擾素的誘導(dǎo)表達(dá)過程中發(fā)揮著重要作用。最初IRF7因結(jié)合EB病毒編碼基因EBNA-1的Qq啟動(dòng)子區(qū)域而被發(fā)現(xiàn)［1］。IRF7在大多數(shù)細(xì)胞中呈低水平表達(dá)，但當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染、脂多糖、干擾素、某些化學(xué)物質(zhì)如丁酸鈉刺激后，細(xì)胞內(nèi)的IRF7表達(dá)水平會(huì)迅速升高，進(jìn)而誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá)［2］。IRF7除了參與調(diào)節(jié)干擾素介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)外，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和凋亡、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和激活等過程［3-5］。目前，有關(guān)IRF7的研究主要集中在哺乳動(dòng)物，而對(duì)于禽類IRF7的研究相對(duì)較少，本研究旨在通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)雞干擾素調(diào)節(jié)因子7（chIRF7）蛋白，并以其為免疫原制備鼠抗雞干擾素調(diào)節(jié)因子7（chIRF7）蛋白多克隆抗體，為進(jìn)一步研究家禽免疫調(diào)節(jié)過程中chIRF7的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 原核表達(dá)載體pET30a，感受態(tài)細(xì)胞JM109、BL21（DE3）均由本實(shí)驗(yàn)室保存，9日齡～11日齡SPF雞胚與6周齡～8周齡Balb／c雌性小鼠購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 Phusion高保真DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ均購自NEB公司；Ligation High高效連接試劑盒購自Toyobo公司；RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；質(zhì)粒小提和膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；His·Bind Resin購自Novagen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；IPTG和DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；Protein Marker購自Fermentas公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自Southernbiotech公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的chIRF7的mRNA序列（登錄號(hào)為205372.1），通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增chIRF7開放閱讀框全長的特異性引物，引物序列如下：

chIRF7UP：5′-CCGGAATTCGCA GCACTGGACAGCGAG-3′（下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），

chIRF7Low：5′-ATAGTTTAGCGGCCGCTC-AGTCTGTCTGCATGTG-3′（下劃線處為NotⅠ酶切位點(diǎn)）。

1.2.2 雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）總RNA的提取 以禽流感病毒感染CEF細(xì)胞，感染12h后收集CEF細(xì)胞，按照Qiagen公司RNA提取試劑盒說明，提取CEF細(xì)胞總RNA。

1.2.3 chIRF7的RT-PCR擴(kuò)增 以提取的CEF細(xì)胞總RNA為模板，參照Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以反轉(zhuǎn)制備的cDNA為模板，利用高保真Phusion DNA聚合酶，擴(kuò)增chIRF7ORF全長，反應(yīng)程序如下：98℃30 s；98℃10s，63℃30s，72℃50s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

1.2.4 PET30a-chIRF7重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將chIRF7的PCR純化產(chǎn)物與原核表達(dá)載體PET30a分別用EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，然后連接、轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取卡那霉素抗性平板中單菌落過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通過PCR、酶切、測序篩選陽性重組質(zhì)粒。

1.2.5 chIRF7蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將測序正確的重組質(zhì)粒PET30a-chIRF7轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3），挑取單菌落，過夜培養(yǎng)后，以1∶100比例接種至新鮮卡那霉素抗性的液體LB中，待菌液OD 600達(dá)到0.6～1.0時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol／L的IPTG，于37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，取菌液與2×SDS Loading buffer等體積混合，沸水煮5min后置于冰上冷卻，通過SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)情況。對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化后，大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，并利用Novagen公司的His·Bind Resin純化重組蛋白。

1.2.6 鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗體的制備 取純化好的chIRF7蛋白與等體積弗氏完全佐劑乳化均勻后免疫接種6周齡～8周齡Balb／c小鼠，首免后每隔2周用chIRF7蛋白與等體積弗氏不完全佐劑乳化均勻后加強(qiáng)免疫接種兩次，三免后10d，斷尾采血通過間接ELISA測定血清抗體效價(jià)。

1.2.7 間接免疫熒光技術(shù)（IFA）檢測chIRF7蛋白多抗的反應(yīng)性 以禽流感病毒感染CEF細(xì)胞，分別于感染后0、4、8、12h，取細(xì)胞用40g／L多聚甲醛室溫固定15min，5mL／L Triton X-100通透10min，然后將小鼠抗chIRF7蛋白多抗血清1∶500稀釋作為一抗，37℃孵育1h，PBST洗滌3次后，加入1∶1 000稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，PBST洗滌3次后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 chIRF7基因的擴(kuò)增與克隆

以禽流感病毒（AIV）感染CEF細(xì)胞的總RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增出大小約為1 500 bp的chIRF7-ORF基因（圖1），將PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體PET30a分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后連接、轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，將菌液PCR檢測疑似陽性重組質(zhì)粒樣品用EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果可切出大小約為1 500bp的目的片段和5 400bp左右的載體片段（圖2），與預(yù)期大小相符。測序結(jié)果顯示，插入目的片段序列與Gen-Bank中公布的原始序列同源性為100%，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為PET30a-chIRF7。

圖1 chIRF7-ORF的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of chIRF7ORF gene by PCR

圖2 重組質(zhì)粒PET30a-chIRF7的酶切及PCR鑒定Fig.2 Identification of PET30a-chIRF7by enzyme digestions and PCR

2.2 chIRF7重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒PET30a-chIRF7轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)后在60ku處有蛋白表達(dá)，與預(yù)期融合蛋白大小一致。而轉(zhuǎn)化PET30a空載體的對(duì)照組，在此處無蛋白表達(dá)。對(duì)誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果顯示，IPTG濃度對(duì)于目的蛋白的表達(dá)量影響不大，在25℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白能夠大量可溶性表達(dá)。利用Novagen公司的His·Bind Resin對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，取純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果在60ku處可見清晰的蛋白條帶（圖3）。

圖3 SDS-PAGE分析純化的重組chIRF7蛋白Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified rchIRF7proteins

2.3 鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗體效價(jià)測定

以純化好的重組蛋白rchIRF7免疫6周齡～8周齡Balb／c小鼠，三免后10d斷尾采集小鼠血液，分離血清，用間接ELISA測定血清抗體效價(jià)在1∶51 200以上。

2.4 IFA檢測chIRF7蛋白多抗的反應(yīng)性

通過IFA檢測鼠抗chIRF7蛋白多抗血清與AIV感染CEF細(xì)胞內(nèi)chIRF7蛋白的反應(yīng)情況，結(jié)果未受禽流感病毒感染刺激的CEF細(xì)胞檢測不到熒光，而禽流感病毒感染CEF細(xì)胞后4、8、12h均可檢測到特異性熒光，并且產(chǎn)生熒光細(xì)胞的數(shù)目和熒光強(qiáng)度隨著感染時(shí)間的延長而增加（圖4）。

3 討論

IRF3和IRF7具有高度的同源性，是干擾素調(diào)節(jié)因子家族中參與Ⅰ型干擾素表達(dá)調(diào)控的主要成員。IRF3在機(jī)體中呈組成性表達(dá)，以非活化的單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。與IRF3不同，IRF7在大多數(shù)細(xì)胞中的表達(dá)量很低，但它可以被Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的信號(hào)通路激活并大量表達(dá)。在病原微生物入侵后，IRF3首先被活化，活化的IRF3移位至細(xì)胞核，與NF-kB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，誘導(dǎo)早期IFN-β和IFN-α4的表達(dá)。這些快速而低水平表達(dá)的干擾素，可通過干擾素信號(hào)通路的正反饋調(diào)節(jié)誘導(dǎo)IRF7蛋白的大量表達(dá)［6］。因此，在通過IFA檢測chIRF7蛋白多抗反應(yīng)性時(shí)，未感染AIV的CEF細(xì)胞由于體內(nèi)IRF7蛋白含量太低而檢測不到熒光，而在AIV感染的刺激下CEF細(xì)胞內(nèi)IRF7蛋白的表達(dá)量增加，所以AIV感染的CEF細(xì)胞可檢測到熒光，并且熒光強(qiáng)度和產(chǎn)生熒光的細(xì)胞數(shù)目隨著感染時(shí)間的增加而增加。

圖4 IFA檢測chIRF7蛋白多抗的反應(yīng)性Fig.4 Identification the reactivity of chIRF7protein with polyclonal antibody by IFA

本研究在大腸埃希菌中成功地表達(dá)了chIRF7蛋白，將純化的重組蛋白rchIRF7免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的多克隆抗體，間接ELISA測定抗體滴度在1∶51 200以上，該多克隆抗體可以識(shí)別AIV感染的CEF細(xì)胞內(nèi)的chIRF7蛋白，表明制備的多克隆抗體具有良好的特異性，為進(jìn)一步研究chIRF7的生物學(xué)功能奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

［1］ Zhang L，Pagano J S.IRF-7，a new interferon regulatory factor associated with Epstein-Barr virus latency［J］.Mol Cell Biol，1997，17（10）：5748-5757.

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