兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《咀饔醚芯?/h1>
2013-09-21 02:44:34鐘正偉
動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2013年4期
鐘正偉
（承德石油高等專科學(xué)?；瘜W(xué)工程系，河北承德067000）
迄今為止對朊病毒引起的哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如瘋牛病、羊癢病、人庫魯病和克－雅氏癥等仍缺乏有效的治療辦法和治療藥物，利用構(gòu)建的動(dòng)物模型、動(dòng)物細(xì)胞模型、無細(xì)胞模型和酵母模型進(jìn)行抗朊病毒藥物的篩選目前是國際生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［1－5］。借助酵母朊病毒［PSI＋］易于檢測的遺傳表型（紅色為正常型，白色為致病型）及其與哺乳動(dòng)物具有嚴(yán)格種間屏障的優(yōu)勢，Bach等建立了一種安全、高效的基于酵母朊病毒［PSI＋］的抗朊病毒藥物篩選模型，該模型首先利用酵母朊病毒［PSI＋］的表型初篩抗朊病毒候選藥物，然后采用SDS－PAGE／Western blot技術(shù)通過分析藥物作用后酵母朊病毒聚集狀態(tài)來檢測候選藥物的抗朊病毒效果；利用該模型Bach等從近4 000種小分子化合物中篩選發(fā)現(xiàn)了菲啶（phenanthridine）、6－氨基菲啶（6－aminophenanthridine）、胍那芐（guanabenz）等11種化合物可以使酵母朊病毒［PSI＋］的白色表型治愈為紅色表型，同時(shí)其淀粉樣蛋白聚集狀態(tài)可以轉(zhuǎn)換為可溶單體狀態(tài)［6－8］。
盡管目前研究發(fā)現(xiàn)了戊聚糖多硫酸酯、四磺酸基酞菁、兩性霉素B、奎納克林、菲啶和朊病毒抗體ICSM18等一系列代表性抗朊病毒候選藥物，但遺憾的是這些候選藥物在動(dòng)物試驗(yàn)中的效果并不理想［2－5］。近年來文獻(xiàn)報(bào)道了某些中藥對與朊病毒疾病具有相似致病機(jī)制的阿爾茨海默病具有一定療效［9－10］，這暗示了從中藥領(lǐng)域?qū)ふ铱闺貌《舅幬锏目赡苄?。本文借助酵母朊病毒［PSI＋］表型并結(jié)合蛋白水平檢測朊病毒聚集體大小的半變性瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)（semi－denaturing detergent－agarose gel electrophoresis，SDD－AGE），研究發(fā)現(xiàn)了兩面針?biāo)嵛锞哂忻黠@的治愈酵母朊病毒［PSI＋］效果，這一方面為傳統(tǒng)中藥兩面針作為抗朊病毒候選藥物提供了試驗(yàn)依據(jù)，另一方面也將推動(dòng)抗朊病毒中藥制劑的篩選研究。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌種 釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae：MATα kar1 SUQ5 ade2－1 his3Δ202 leu2Δ1 trp1Δ63 ura3－52 erg6：：KanMX，［PSI＋］，美國國立衛(wèi)生院（NIH）的Masison D博士惠贈(zèng)；將［PSI＋］細(xì)胞劃線于含有5mmol／L鹽酸胍的1／2YPD固體平板上培養(yǎng)7d后，分離紅色單菌落得到［PSI＋］細(xì)胞。
1.1.2 培養(yǎng)基 1／2YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉5g／L，蛋白胨20g／L，葡萄糖20g／L，固體平板加入20 g／L瓊脂。
1.1.3 試劑和藥品 兩面針根購自安徽亳州市真源堂藥業(yè)有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉均購自上海奧博星生物科技有限公司；鹽酸胍（guanidine hydrochloride，GuHCl）購自美國Sigma公司；兔抗Sup35抗體與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購于上海西寶生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 兩面針?biāo)嵛锏闹苽?制備兩面針?biāo)嵛锇磪⒄瘴墨I(xiàn)［11］方法并做適當(dāng)調(diào)整，將兩面針根粉碎后80℃烘干，稱取粉末適量置于燒杯中，加相當(dāng)于中藥量20倍的純水浸泡2h后，煮沸30min，抽濾。藥渣加5倍水，煮沸20min，抽濾。合并濾液并于5 000r／min離心5min，去除沉淀后減壓濃縮成相當(dāng)于原藥1g／mL的藥液，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 兩面針?biāo)嵛飳湍干L的抑制作用分析采用二倍稀釋法結(jié)合血球計(jì)數(shù)法分析兩面針?biāo)嵛飳湍干L的影響［12］。取試管數(shù)支，以1／2YPD液體培養(yǎng)基對兩面針?biāo)嵛镞M(jìn)行對倍稀釋，濃度分別為500mg／mL～62.5mg／mL，然后在每管中按10%接種量接種活化培養(yǎng)的OD 600nm為0.5的酵母菌懸液，生長對照為不加藥的1／2YPD液體培養(yǎng)體系。上述各接種物體系置24℃下培養(yǎng)24h，其間每間隔4h采用血球計(jì)數(shù)法監(jiān)測培養(yǎng)體系中酵母總菌落的變化。
1.2.3 兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］表型治療作用分析 按參照文獻(xiàn)方法并做適當(dāng)調(diào)整［6］，［PSI＋］酵母細(xì)胞在30℃過夜活化培養(yǎng)后，調(diào)整菌液OD 600nm為0.2左右，按10%接種量分別接種到含有指定濃度兩面針?biāo)嵛锏?／2YPD液體培養(yǎng)體系，所有體系于24℃震蕩培養(yǎng)5d，在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)間隔24h更換培養(yǎng)基和藥物。每天取培養(yǎng)液稀釋后涂布于1／2YPD固體平板，平板于24℃培養(yǎng)7d，觀察菌落顏色變化，照相并統(tǒng)計(jì)不同表型菌落的比例。
1.2.4 SDD－AGE／Western blot技術(shù)分析兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］的治療效果 SDDAGE／Western blot試驗(yàn)流程按參考文獻(xiàn)［13］進(jìn)行，將兩面針?biāo)嵛镒饔媒湍讣?xì)胞5d后涂布培養(yǎng)的1／2YPD固體平板上出現(xiàn)的不同顏色菌落活化后接種到1／2YPD液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)約12h，到菌液OD 600nm＝1.5左右時(shí)停止培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，然后加入裂解緩沖液，用珠磨儀裂解細(xì)胞，離心收集上清得到蛋白樣品；進(jìn)行15g／L的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后用在0℃、100V條件下轉(zhuǎn)膜1h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，兔抗Sup35抗體（1∶2 000）孵育1h，4℃過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育1h，采用ECL發(fā)光試劑盒對其進(jìn)行放射自顯影檢測，獲得圖像信息。
2 結(jié)果
2.1 兩面針?biāo)嵛飳湍干L的影響
研究表明，抗朊病毒化合物鹽酸胍治療酵母朊病毒［PSI＋］依賴于細(xì)胞分裂［14］，而且分析候選藥物對酵母朊病毒［PSI＋］的治療作用采用24℃液體培養(yǎng)，并間隔24h更換培養(yǎng)液的試驗(yàn)方法要求酵母細(xì)胞具有較快生長速度［6］，為此首先分析了24℃培養(yǎng)條件下不同濃度兩面針?biāo)嵛飳湍讣?xì)胞生長的影響。如圖1所示，不加藥情況下，酵母生長繁殖正常，菌落數(shù)量有規(guī)律地增加；兩面針?biāo)嵛餄舛葹?2.5mg／mL、125mg／mL時(shí)，對酵母生長的影響不大，菌落數(shù)量增長規(guī)律與未加藥的基本接近；兩面針?biāo)嵛餄舛葹?50mg／mL、500mg／mL時(shí)，酵母細(xì)胞總數(shù)基本維持在接種時(shí)的水平，僅在小范圍內(nèi)波動(dòng)，這表明兩面針?biāo)嵛餄舛雀哂?50mg／mL時(shí)抑制酵母生長。
圖1 兩面針?biāo)嵛飳湍干L的影響Fig.1 Effects of aqueous extract fromZanthoxylum nitidum on cell growth of yeast prion
2.2 兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］表型的影響
酵母朊病毒［PSI＋］是酵母翻譯終止因子Sup35p的淀粉樣聚集形式，在［PSI＋］細(xì)胞中，Sup35p主要以聚集體形式存在導(dǎo)致無義突變抑制，產(chǎn)生終止密碼子通讀現(xiàn)象，使ade2－1突變的［PSI＋］細(xì)胞在腺嘌呤缺乏的培養(yǎng)基上生長為白色菌落；在被治愈的［PSI－］細(xì)胞中，其Sup35p主要以可溶形式存在，非無義抑制的ade2－1突變株需要在含有腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長，細(xì)胞由于累積腺嘌呤合成途徑中的紅色中間產(chǎn)物而形成紅色菌落，這個(gè)表型系統(tǒng)可用來初步分析藥物對［PSI＋］表型的治療效果［6，15］。依據(jù)結(jié)果2.1，研究25、50、75、100、125mg／mL兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］表型的治療作用，如圖2所示，陽性對照5mmol／L鹽酸胍作用白色［PSI＋］細(xì)胞后產(chǎn)生的紅色菌落隨著作用時(shí)間增加而增多；作用5d后紅色菌落比例為94.8%；兩面針?biāo)嵛餄舛葹?5mg／mL時(shí)作用［PSI＋］細(xì)胞不產(chǎn)生紅色菌落，與不加藥陰性對照的結(jié)果相同；當(dāng)兩面針?biāo)嵛餄舛雀哂?5mg／mL時(shí)，作用［PSI＋］細(xì)胞后產(chǎn)生的紅色菌落比列與藥物作用時(shí)間、藥物劑量均呈現(xiàn)較好的正相關(guān)性，并且125 mg／mL的兩面針?biāo)嵛镒饔茫跴SI＋］細(xì)胞5d后紅色菌落比例為90.2%，僅略低于陽性對照的作用效果，這表明兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］表型具有明顯的治療作用。
圖2 酵母朊病毒［PSI＋］在兩面針?biāo)嵛镒饔貌煌瑫r(shí)間后的表型變化Fig.2 Phenotype changes of［PSI＋］cells after treatment with ZA in different time
2.3 蛋白水平分析兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］的治療作用
Bach S等［6］在蛋白水平分析候選藥物對酵母朊病毒［PSI＋］的治療效果時(shí)采用的傳統(tǒng)SDSPAGE／Western blot技術(shù)僅能分析朊病毒能否發(fā)生聚集，而近年來發(fā)展的半變性瓊脂糖凝膠電泳（SDD－AGE）結(jié)合 Western blot技術(shù)能夠精確檢測朊病 毒 聚 集 體 大 ?。?3，16－17］，因 此 引 入 SDD－AGE／Western blot技術(shù)分析兩面針?biāo)嵛镒饔媒湍鸽貌《荆跴SI＋］細(xì)胞后的朊病毒聚集體大小。如圖3所示，對照的［PSI＋］細(xì)胞朊病毒Sup35p主要以大分子聚集體形式存在，而［PSI－］細(xì)胞朊病毒Sup35p主要以可溶的小分子單體形式存在，兩面針?biāo)嵛镒饔?［PSI＋］細(xì)胞5d后白色菌落的朊病毒Sup35p聚集體大小與［PSI＋］細(xì)胞相似，說明這些菌落沒有被治愈；兩面針?biāo)嵛镒饔茫跴SI＋］細(xì)胞5d后紅色菌落的朊病毒Sup35p主要以單體形式存在，與［PSI－］細(xì)胞的朊病毒Sup35p大小相當(dāng)，說明這些菌落為兩面針?biāo)嵛镏斡模跴SI－］細(xì)胞。
圖3 SDD－AGE／Western blot分析兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］的作用Fig.3 Analysis of effects of ZA on yeast prion［PSI＋］cells with SDD－AGE／Western blot
3 討論
本文借助酵母朊病毒［PSI＋］表型和蛋白水平的SDD－AGE／Western blot技術(shù)分析了兩面針?biāo)嵛锏目闺貌《咀饔?；研究結(jié)果表明兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］具有明顯的治療效果。前期研究表明菲啶和某些菲啶衍生物能夠治愈酵母朊病毒［6］，另外兩面針提取物中的苯并菲啶類生物堿成分如氧化兩面針堿、二氫白屈菜紅堿、去－N－甲基白屈菜紅堿等與菲啶具有相同的母體結(jié)構(gòu)［6，18］，推測兩面針?biāo)嵛锬軌蛑斡湍鸽貌《荆跴SI＋］可能與其生物堿成分有關(guān)，但這仍需要更多的研究來證實(shí)。重要的是，本文研究報(bào)道了傳統(tǒng)中藥兩面針?biāo)嵛锞哂兄委熃湍鸽貌《净钚?，一方面為兩面針作為抗朊病毒候選藥物提供了試驗(yàn)依據(jù)，另一方面也將促進(jìn)從中藥領(lǐng)域?qū)ふ译貌《炯膊≈委熕幬锏难芯俊?/p>
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盡管目前研究發(fā)現(xiàn)了戊聚糖多硫酸酯、四磺酸基酞菁、兩性霉素B、奎納克林、菲啶和朊病毒抗體ICSM18等一系列代表性抗朊病毒候選藥物，但遺憾的是這些候選藥物在動(dòng)物試驗(yàn)中的效果并不理想［2－5］。近年來文獻(xiàn)報(bào)道了某些中藥對與朊病毒疾病具有相似致病機(jī)制的阿爾茨海默病具有一定療效［9－10］，這暗示了從中藥領(lǐng)域?qū)ふ铱闺貌《舅幬锏目赡苄?。本文借助酵母朊病毒［PSI＋］表型并結(jié)合蛋白水平檢測朊病毒聚集體大小的半變性瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)（semi－denaturing detergent－agarose gel electrophoresis，SDD－AGE），研究發(fā)現(xiàn)了兩面針?biāo)嵛锞哂忻黠@的治愈酵母朊病毒［PSI＋］效果，這一方面為傳統(tǒng)中藥兩面針作為抗朊病毒候選藥物提供了試驗(yàn)依據(jù)，另一方面也將推動(dòng)抗朊病毒中藥制劑的篩選研究。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌種 釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae：MATα kar1 SUQ5 ade2－1 his3Δ202 leu2Δ1 trp1Δ63 ura3－52 erg6：：KanMX，［PSI＋］，美國國立衛(wèi)生院（NIH）的Masison D博士惠贈(zèng)；將［PSI＋］細(xì)胞劃線于含有5mmol／L鹽酸胍的1／2YPD固體平板上培養(yǎng)7d后，分離紅色單菌落得到［PSI＋］細(xì)胞。
1.1.2 培養(yǎng)基 1／2YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉5g／L，蛋白胨20g／L，葡萄糖20g／L，固體平板加入20 g／L瓊脂。
1.1.3 試劑和藥品 兩面針根購自安徽亳州市真源堂藥業(yè)有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉均購自上海奧博星生物科技有限公司；鹽酸胍（guanidine hydrochloride，GuHCl）購自美國Sigma公司；兔抗Sup35抗體與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購于上海西寶生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 兩面針?biāo)嵛锏闹苽?制備兩面針?biāo)嵛锇磪⒄瘴墨I(xiàn)［11］方法并做適當(dāng)調(diào)整，將兩面針根粉碎后80℃烘干，稱取粉末適量置于燒杯中，加相當(dāng)于中藥量20倍的純水浸泡2h后，煮沸30min，抽濾。藥渣加5倍水，煮沸20min，抽濾。合并濾液并于5 000r／min離心5min，去除沉淀后減壓濃縮成相當(dāng)于原藥1g／mL的藥液，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 兩面針?biāo)嵛飳湍干L的抑制作用分析采用二倍稀釋法結(jié)合血球計(jì)數(shù)法分析兩面針?biāo)嵛飳湍干L的影響［12］。取試管數(shù)支，以1／2YPD液體培養(yǎng)基對兩面針?biāo)嵛镞M(jìn)行對倍稀釋，濃度分別為500mg／mL～62.5mg／mL，然后在每管中按10%接種量接種活化培養(yǎng)的OD 600nm為0.5的酵母菌懸液，生長對照為不加藥的1／2YPD液體培養(yǎng)體系。上述各接種物體系置24℃下培養(yǎng)24h，其間每間隔4h采用血球計(jì)數(shù)法監(jiān)測培養(yǎng)體系中酵母總菌落的變化。
1.2.3 兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］表型治療作用分析 按參照文獻(xiàn)方法并做適當(dāng)調(diào)整［6］，［PSI＋］酵母細(xì)胞在30℃過夜活化培養(yǎng)后，調(diào)整菌液OD 600nm為0.2左右，按10%接種量分別接種到含有指定濃度兩面針?biāo)嵛锏?／2YPD液體培養(yǎng)體系，所有體系于24℃震蕩培養(yǎng)5d，在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)間隔24h更換培養(yǎng)基和藥物。每天取培養(yǎng)液稀釋后涂布于1／2YPD固體平板，平板于24℃培養(yǎng)7d，觀察菌落顏色變化，照相并統(tǒng)計(jì)不同表型菌落的比例。
1.2.4 SDD－AGE／Western blot技術(shù)分析兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］的治療效果 SDDAGE／Western blot試驗(yàn)流程按參考文獻(xiàn)［13］進(jìn)行，將兩面針?biāo)嵛镒饔媒湍讣?xì)胞5d后涂布培養(yǎng)的1／2YPD固體平板上出現(xiàn)的不同顏色菌落活化后接種到1／2YPD液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)約12h，到菌液OD 600nm＝1.5左右時(shí)停止培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，然后加入裂解緩沖液，用珠磨儀裂解細(xì)胞，離心收集上清得到蛋白樣品；進(jìn)行15g／L的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后用在0℃、100V條件下轉(zhuǎn)膜1h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，兔抗Sup35抗體（1∶2 000）孵育1h，4℃過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育1h，采用ECL發(fā)光試劑盒對其進(jìn)行放射自顯影檢測，獲得圖像信息。
2 結(jié)果
2.1 兩面針?biāo)嵛飳湍干L的影響
研究表明，抗朊病毒化合物鹽酸胍治療酵母朊病毒［PSI＋］依賴于細(xì)胞分裂［14］，而且分析候選藥物對酵母朊病毒［PSI＋］的治療作用采用24℃液體培養(yǎng)，并間隔24h更換培養(yǎng)液的試驗(yàn)方法要求酵母細(xì)胞具有較快生長速度［6］，為此首先分析了24℃培養(yǎng)條件下不同濃度兩面針?biāo)嵛飳湍讣?xì)胞生長的影響。如圖1所示，不加藥情況下，酵母生長繁殖正常，菌落數(shù)量有規(guī)律地增加；兩面針?biāo)嵛餄舛葹?2.5mg／mL、125mg／mL時(shí)，對酵母生長的影響不大，菌落數(shù)量增長規(guī)律與未加藥的基本接近；兩面針?biāo)嵛餄舛葹?50mg／mL、500mg／mL時(shí)，酵母細(xì)胞總數(shù)基本維持在接種時(shí)的水平，僅在小范圍內(nèi)波動(dòng)，這表明兩面針?biāo)嵛餄舛雀哂?50mg／mL時(shí)抑制酵母生長。
圖1 兩面針?biāo)嵛飳湍干L的影響Fig.1 Effects of aqueous extract fromZanthoxylum nitidum on cell growth of yeast prion
2.2 兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］表型的影響
酵母朊病毒［PSI＋］是酵母翻譯終止因子Sup35p的淀粉樣聚集形式，在［PSI＋］細(xì)胞中，Sup35p主要以聚集體形式存在導(dǎo)致無義突變抑制，產(chǎn)生終止密碼子通讀現(xiàn)象，使ade2－1突變的［PSI＋］細(xì)胞在腺嘌呤缺乏的培養(yǎng)基上生長為白色菌落；在被治愈的［PSI－］細(xì)胞中，其Sup35p主要以可溶形式存在，非無義抑制的ade2－1突變株需要在含有腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長，細(xì)胞由于累積腺嘌呤合成途徑中的紅色中間產(chǎn)物而形成紅色菌落，這個(gè)表型系統(tǒng)可用來初步分析藥物對［PSI＋］表型的治療效果［6，15］。依據(jù)結(jié)果2.1，研究25、50、75、100、125mg／mL兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］表型的治療作用，如圖2所示，陽性對照5mmol／L鹽酸胍作用白色［PSI＋］細(xì)胞后產(chǎn)生的紅色菌落隨著作用時(shí)間增加而增多；作用5d后紅色菌落比例為94.8%；兩面針?biāo)嵛餄舛葹?5mg／mL時(shí)作用［PSI＋］細(xì)胞不產(chǎn)生紅色菌落，與不加藥陰性對照的結(jié)果相同；當(dāng)兩面針?biāo)嵛餄舛雀哂?5mg／mL時(shí)，作用［PSI＋］細(xì)胞后產(chǎn)生的紅色菌落比列與藥物作用時(shí)間、藥物劑量均呈現(xiàn)較好的正相關(guān)性，并且125 mg／mL的兩面針?biāo)嵛镒饔茫跴SI＋］細(xì)胞5d后紅色菌落比例為90.2%，僅略低于陽性對照的作用效果，這表明兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］表型具有明顯的治療作用。
圖2 酵母朊病毒［PSI＋］在兩面針?biāo)嵛镒饔貌煌瑫r(shí)間后的表型變化Fig.2 Phenotype changes of［PSI＋］cells after treatment with ZA in different time
2.3 蛋白水平分析兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］的治療作用
Bach S等［6］在蛋白水平分析候選藥物對酵母朊病毒［PSI＋］的治療效果時(shí)采用的傳統(tǒng)SDSPAGE／Western blot技術(shù)僅能分析朊病毒能否發(fā)生聚集，而近年來發(fā)展的半變性瓊脂糖凝膠電泳（SDD－AGE）結(jié)合 Western blot技術(shù)能夠精確檢測朊病 毒 聚 集 體 大 ?。?3，16－17］，因 此 引 入 SDD－AGE／Western blot技術(shù)分析兩面針?biāo)嵛镒饔媒湍鸽貌《荆跴SI＋］細(xì)胞后的朊病毒聚集體大小。如圖3所示，對照的［PSI＋］細(xì)胞朊病毒Sup35p主要以大分子聚集體形式存在，而［PSI－］細(xì)胞朊病毒Sup35p主要以可溶的小分子單體形式存在，兩面針?biāo)嵛镒饔?［PSI＋］細(xì)胞5d后白色菌落的朊病毒Sup35p聚集體大小與［PSI＋］細(xì)胞相似，說明這些菌落沒有被治愈；兩面針?biāo)嵛镒饔茫跴SI＋］細(xì)胞5d后紅色菌落的朊病毒Sup35p主要以單體形式存在，與［PSI－］細(xì)胞的朊病毒Sup35p大小相當(dāng)，說明這些菌落為兩面針?biāo)嵛镏斡模跴SI－］細(xì)胞。
圖3 SDD－AGE／Western blot分析兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］的作用Fig.3 Analysis of effects of ZA on yeast prion［PSI＋］cells with SDD－AGE／Western blot
3 討論
本文借助酵母朊病毒［PSI＋］表型和蛋白水平的SDD－AGE／Western blot技術(shù)分析了兩面針?biāo)嵛锏目闺貌《咀饔?；研究結(jié)果表明兩面針?biāo)嵛飳湍鸽貌《荆跴SI＋］具有明顯的治療效果。前期研究表明菲啶和某些菲啶衍生物能夠治愈酵母朊病毒［6］，另外兩面針提取物中的苯并菲啶類生物堿成分如氧化兩面針堿、二氫白屈菜紅堿、去－N－甲基白屈菜紅堿等與菲啶具有相同的母體結(jié)構(gòu)［6，18］，推測兩面針?biāo)嵛锬軌蛑斡湍鸽貌《荆跴SI＋］可能與其生物堿成分有關(guān)，但這仍需要更多的研究來證實(shí)。重要的是，本文研究報(bào)道了傳統(tǒng)中藥兩面針?biāo)嵛锞哂兄委熃湍鸽貌《净钚?，一方面為兩面針作為抗朊病毒候選藥物提供了試驗(yàn)依據(jù)，另一方面也將促進(jìn)從中藥領(lǐng)域?qū)ふ译貌《炯膊≈委熕幬锏难芯俊?/p>
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