王 敏，小 琴，那日蘇，2，王彩鳳，特尼格爾，趙 慧，格日勒?qǐng)D＊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古錫林郭勒026000）

S層蛋白（S-layer protein，SLP）位于細(xì)菌細(xì)胞的最外層，是一類表面結(jié)構(gòu)蛋白，這層結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的生存及完整性有著很重要的作用［1］。S層蛋白是由蛋白質(zhì)或糖蛋白亞基組成的單分子晶體點(diǎn)陣，它們形成有孔的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)覆蓋在細(xì)胞表面［2］。S層蛋白具有方形或六邊形對(duì)稱結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量為40ku～200ku，大量的研究表明，S層蛋白可能與細(xì)菌的黏附有關(guān)［3-4］。關(guān)于細(xì)菌S層蛋白應(yīng)用方面的研究逐漸興起，如生物技術(shù)、納米技術(shù)、納米生物技術(shù)和仿 生技術(shù) 等［5-6］。S層蛋白也存在于某些乳桿菌屬的細(xì)菌表面，如嗜酸乳桿菌、短小乳桿菌、瑞士乳桿菌、彎曲乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、雞乳桿菌等。現(xiàn)在普遍認(rèn)為S層蛋白是某些乳酸菌的黏附素之一［7］。

嗜酸乳桿菌與腸黏膜上皮細(xì)胞相互作用、密切結(jié)合構(gòu)成了生物學(xué)屏障，通過其自身及其代謝物與其它細(xì)菌之間的相互作用，阻止了致病菌的定植和入侵，拮抗致病菌和有害微生物的生長(zhǎng)及其毒素的黏附［8］。該菌能分泌包括S層蛋白在內(nèi)的多種蛋白或酶，促進(jìn)蛋白質(zhì)的消化吸收，并抑制了致癌物質(zhì)的產(chǎn)生，其代謝物活化了免疫功能，抑制宿主癌細(xì)胞的形成和增殖［9］。但是S層蛋白在這些過程中如何發(fā)揮作用尚未見到相關(guān)研究報(bào)道。

本試驗(yàn)對(duì)分離自內(nèi)蒙古的嗜酸性乳桿菌MG株的slp基因氨基酸序列進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并構(gòu)建了slp基因的原核表達(dá)載體pGEX-slp，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得成功表達(dá)，得到GST融合的S層蛋白。該融合蛋白的成功表達(dá)為進(jìn)一步研制相關(guān)的生物制品奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)料與菌種 嗜酸性乳桿菌MG株，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并保存；pMD-19T，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；pGEX4T-3，Invitrgen公司產(chǎn)品；E.coli DH5α、E.coli BL21均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與儀器 普通質(zhì)粒小提取試劑盒，Tiangen公司產(chǎn)品；Taq DNA 聚合酶、XhoⅠ、BamHⅠ、pMD-19T，膠回收試劑盒，均購(gòu)自Takara公司；鼠抗GST血清，日本帶廣畜產(chǎn)大學(xué)原蟲病研究中心制備；綿羊抗鼠IgG-HRP，Invitrogen公司產(chǎn)品；氨芐青霉素，Sanland-chem公司產(chǎn)品。

冷凍離心機(jī)，PCR儀，電泳儀（DYY-12型），凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物并由上海桑尼公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 200bp：

上 游 引 物Pacid-F：5＇-GCCGGATCCATTGTTAGCGCTCCTG-3＇（下劃線處為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）；下 游 引 物Pacid-R：5＇-CACCTCGAGTTAGACCCGACGGCCA-3＇（下劃線處為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 嗜酸性乳桿菌MG株的slp基因的擴(kuò)增與克隆 參照雙杰等［10］的方法，提取嗜酸性乳桿菌MG株基因組DNA，以其為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增slp基因片段，PCR反應(yīng)具體程序如下：95℃預(yù)變性5min；95℃1min，55℃1min，72℃1.5min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收slp基因片段，16℃與pMD19-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有Amp抗性的平板，37℃進(jìn)行過夜培養(yǎng)，試劑提取重組克隆質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序，將該質(zhì)粒命名為pMD-slp。

1.2.2 SLP蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用CPH models-3.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／CPHmodels）在線軟件對(duì)SLP蛋白質(zhì)進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；并利用同源建模原理使用Swiss-Model和Swiss-PdbViewer軟件獲得了SLP蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)3D模擬圖。

1.2.3 原核表達(dá)載體pGEX-slp的構(gòu)建 用BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)pMD-slp進(jìn)行雙酶切，膠回收純化slp基因片段，將其定向克隆到經(jīng)同樣酶切的pGEX-4T-3表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定重組表達(dá)載體pGEX-slp，并在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 重組蛋白SDS-PAGE分析 參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第3版）［11］提供的原核表達(dá)方法，將含有重組表達(dá)載體的BL21菌液，37℃振蕩培養(yǎng)至OD 600nm值達(dá)到0.6左右時(shí)，加入IPTG（終濃度為0.5mmol／L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5h，取樣后12 000 r／min離心5min收集菌體，加1×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸10min后，冰浴5min，12 000r／min離心5min，取10μL上清上樣于120g／L的SDSPAGE膠，進(jìn)行電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 將SDS-PAGE膠上的目的條帶轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用50g／L脫脂乳4℃封閉過夜，加鼠抗GST血清（一抗，1∶1 000稀釋）室溫作用1h，PBS緩沖液洗3次，每次15min；加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的綿羊抗鼠IgG抗體（二抗，1∶5 000稀釋）室溫作用1h，PBS緩沖液洗3次，每次15min，在二氨基聯(lián)苯胺（DAB）緩沖液中顯色。

2 結(jié)果

2.1 slp基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

嗜酸性乳桿菌slp基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在位于約1 260bp處有一條特異性DNA擴(kuò)增條帶，與預(yù)期理論值大小一致（圖1）。

圖1 slp基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The amplification of slp gene by PCR

2.2 重組載體pGEX-slp的酶切鑒定和PCR鑒定

嗜酸性乳桿菌slp基因大小約為1 200bp，pGEX-4T-3大小約為5 500bp，將重組質(zhì)粒pGEX-slp用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上，分別出現(xiàn)約5 000bp和1 200bp左右的特異性條帶（圖2）。PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，在2 000bp和1 000bp之間有一特異性條帶，符合理論值1 260bp的大小。

2.3 嗜酸性乳桿菌SLP蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測(cè)

應(yīng)用Genetyx生物軟件推導(dǎo)出的SLP蛋白質(zhì)氨基酸序列，嗜酸性乳桿菌MG株的SLP蛋白共由414個(gè)氨基酸組成（圖4）。

2.4 SLP蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用3種在線軟件對(duì)SLP蛋白質(zhì)進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5（A～C）所示，3種不同軟件預(yù)測(cè)出3D空間結(jié)構(gòu)驚人相似，表明預(yù)測(cè)結(jié)果的高重復(fù)性。

2.5 SDS-PAGE與Western blot分析結(jié)果

對(duì)重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。如圖6所示，IPTG誘導(dǎo)5h后在70ku處出現(xiàn)了條帶（第2泳道），而未加IPTG的同一個(gè)菌樣在同一時(shí)間未出現(xiàn)類似條帶（第1泳道）。以鼠抗GST血清為一抗，對(duì)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot的結(jié)果如圖7所示，試驗(yàn)組重組菌樣品（含pGEX-slp）約在70ku處出現(xiàn)特異性條帶，與SDS-PAGE結(jié)果相符，并在27ku處也出現(xiàn)與對(duì)照組樣品（含pGEX-4t-3空質(zhì)粒）相同的條帶（泳道2）。而對(duì)照組樣品（含pGEX-4t-3空質(zhì)粒）除了27ku處的特異性條帶以外還有一條明顯大于70ku的非特異性條帶（泳道1）。

圖2 重組載體的pGEX-slp的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plamid pGEX-slp by BamHⅠand XhoⅠdigestion

圖3 重組載體的PCR鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid pGEX-slp by PCR

圖4 SLP蛋白質(zhì)的氨基酸序列Fig.4 Amino acid sequence of SLP protein

圖5 slp的3D預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 Prediction results of slp 3D

圖6 SLP蛋白表達(dá)的SDS-PAG鑒定結(jié)果Fig.6 Identification of the expression of SLP proteinsby SDS-PAGE

圖7 SLP蛋白Western blot鑒定結(jié)果Fig.7 Identification of the expression of SLP proteins by Western blot

3 討論

細(xì)菌S層蛋白因其本身具有的單分子晶體層結(jié)構(gòu)，從而使其具有佐劑的活性，能夠?qū)⒖乖砦换蛘叩鞍踪|(zhì)展示在細(xì)胞表面，是一種高效的攜載抗原的物質(zhì)［12］。S層蛋白的C端可以融合抗原蛋白，使其準(zhǔn)確嵌入到S層蛋白晶格中，然后具有活性的融合蛋白部分就能夠被錨定在細(xì)胞膜表面［13-14］?，F(xiàn)在許多的在線生物軟件可以通過同源建模的原理，能夠預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)用CPHmodels，Swiss-Model和Swiss-PdbViewer 3種軟件對(duì)嗜酸性乳桿菌SLP蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種不同的軟件預(yù)測(cè)SLP蛋白的結(jié)構(gòu)相似性很高，其中α螺旋占3.33%，線性結(jié)構(gòu)占45%，無(wú)規(guī)則卷曲占51.67%，親水性氨基酸占59.1%。1～20氨基酸為N端信號(hào)肽跨膜結(jié)構(gòu)域，充分展現(xiàn)出外膜蛋白質(zhì)的特性。這對(duì)今后slp基因的遺傳改造，進(jìn)一步膜蛋白質(zhì)特性分析以及嵌入外源基因提供了理論依據(jù)。S層蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的這種信號(hào)肽活性以及疏水性等特性與Hein J B等［15］報(bào)道結(jié)果極其相似，國(guó)內(nèi)尚未見類似報(bào)道。

本試驗(yàn)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-slp并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)有效表達(dá)出GST融合的SLP蛋白質(zhì)。Western blot鑒定試驗(yàn)結(jié)果表明該融合蛋白可被鼠抗GST抗體所識(shí)別。在試驗(yàn)組重組菌樣品（含pGEX-slp質(zhì)粒）中出現(xiàn)了2個(gè)條帶，大小分別約為70ku和27ku，前者與SLP和GST融合后的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小基本吻合，后者與GST融合蛋白大小基本吻合。這表明SLP融合蛋白不穩(wěn)定，容易裂解，其原因可能與slp基因的信號(hào)肽序列表達(dá)產(chǎn)物的斷裂有關(guān)，因?yàn)楸驹囼?yàn)中slp基因進(jìn)行融合的時(shí)候信號(hào)肽序列部分未進(jìn)行剪切。由于斷裂以后的SLP部分不會(huì)被鼠抗GST血清所識(shí)別，所以Western blot鑒定試驗(yàn)結(jié)果中未出現(xiàn)該條帶。此外，在對(duì)照組樣品試驗(yàn)中，除了GST實(shí)際大小吻合的27 ku的特異性條帶以外還出現(xiàn)了明顯大于70ku的非特異性條帶，其原因仍需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。本試驗(yàn)為重組蛋白SLP的生物活性和相關(guān)應(yīng)用的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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