王思蘆

（西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，四川西昌615013）

脾臟和胸腺是小鼠重要的免疫器官，也是外周淋巴細(xì)胞分化與成熟的地方，其組織結(jié)構(gòu)的變化必將影響免疫細(xì)胞的成熟和功能。據(jù)報道，一些免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、氫化可的松、地塞米松等藥物可導(dǎo)致免疫器官發(fā)生萎縮，使小鼠免疫器官指數(shù)降低，外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，從而使小鼠細(xì)胞免疫功能受到嚴(yán)重的抑制［1-3］。雞樅菌是一種珍稀食用及藥用真菌，據(jù)報道其提取物具有抗高血脂［4］，抗氧化［5］，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖等作用［6］，對小鼠體液及細(xì)胞免疫功能均有一定的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)主要探討了雞樅菌多糖（TAP）對CTX引起脾臟及胸腺器質(zhì)性損傷的拮抗作用，從免疫器官重量和組織結(jié)構(gòu)的變化分析TAP對小鼠免疫功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 雞樅菌多糖由動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，多糖純度為92.17%；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號20100509）；甲醛，乙醇，二甲苯，伊紅，蘇木精，石蠟等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 50只健康昆明小鼠，體重20g～22g，雌雄各半，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 將50只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組及TAP高、中、低劑量組，每組10只。空白組和模型組每天腹腔注射生理鹽水0.2mL，TAP高、中、低劑量組分別每天腹腔注射TAP 200、100、50mg／kg，連續(xù)7d；給藥后第5天，除空白組外，其余各組每天腹腔注射環(huán)磷酰胺（CTX）100 mg／kg，連續(xù)3d，于第8天處死。

1.2.2 小鼠脾臟及胸腺指數(shù)測定 處死小鼠后，將其脾臟和胸腺周圍組織剝離干凈后分別稱重，按以下公式［7］計算免疫器官指數(shù)：

1.2.3 小鼠脾臟和胸腺組織切片制作 將各組小鼠的脾臟和胸腺浸泡于40mL／L甲醛溶液固定24 h，流水浸洗30min，經(jīng)過750、850、950、1 000mL／L乙醇依次脫水6h，甲苯處理3h，石蠟液浸泡40min后包埋、切片；將切片以蘇木素染色10min，水洗后以10mL／L鹽酸酒精處理40s，水洗，5mL／L氨水處理5s，伊紅染色10min，再由750、850、950、1 000 mL／L乙醇依次脫色，經(jīng)過甲苯透明15min后以樹脂封片鏡檢［8］。記錄各組脾臟和胸腺組織結(jié)構(gòu)的變化特點(diǎn)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS13.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用Duncan法進(jìn)行多重比較分析組間差異。

2 結(jié)果

2.1 TAP拮抗CTX對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組的脾臟和胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；而與模型組相比，50mg／kg～200 mg／kg TAP均能極顯著提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.01）及胸腺指數(shù)（P＜0.01），且以高劑量TAP效果最佳，可使脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別比模型組提高113.3%和101.1%（表1）。

表1 TAP拮抗CTX對小鼠免疫器官指數(shù)的影響Table 1 The antagonism of TAP to CTX on immune organ indexes in mice

2.2 TAP拮抗CTX對小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

空白組脾臟結(jié)構(gòu)清晰，可見由排列緊密的淋巴細(xì)胞構(gòu)成的脾小結(jié)和其周圍含有大量紅細(xì)胞的紅髓，以及富含巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血管的邊緣區(qū)。模型組與空白組相比，其脾臟動脈周圍淋巴鞘結(jié)構(gòu)模糊，脾小結(jié)顯著縮小，其中細(xì)胞數(shù)量減少且結(jié)構(gòu)模糊，生發(fā)中心不明顯，邊緣區(qū)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量也顯著減少，紅髓與邊緣區(qū)界限不明顯，脾竇變小。與模型組相比，高劑量TAP組的脾臟邊緣區(qū)細(xì)胞數(shù)量顯著增多，脾小結(jié)增大且細(xì)胞數(shù)量增多，脾竇擴(kuò)大，紅白髓界限明顯（圖1～圖3）。

圖1 空白組小鼠脾小結(jié)（HE，100×）Fig.1 Splenic nodule of mouse in control group（HE，100×）

圖2 模型組小鼠脾小結(jié)（HE，100×）Fig.2 Splenic nodule of mouse in modle group（HE，100×）

圖3 高劑量TAP組小鼠脾小結(jié)（HE，100×）Fig.3 Splenic nodule of mouse in high dose TAP group（HE，100×）

2.3 TAP拮抗CTX對小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)的影響

空白組胸腺組織皮質(zhì)和髓質(zhì)界限清楚，其中皮質(zhì)較厚，有大量排列緊密的淋巴細(xì)胞，使皮質(zhì)著色較深；而髓質(zhì)部染色較淺，可見較多上皮網(wǎng)狀細(xì)胞和少量淋巴細(xì)胞。模型組胸腺組織明顯萎縮，皮髓質(zhì)分界模糊；在皮質(zhì)區(qū)，淋巴細(xì)胞顯著減少，可見被其掩蔽的上皮網(wǎng)狀細(xì)胞顯露出來，細(xì)胞間隙增寬；在髓質(zhì)可見淋巴細(xì)胞增多，染色較深。與模型組相比，高劑量TAP組胸腺皮質(zhì)區(qū)顯著增厚，淋巴細(xì)胞增多，皮髓質(zhì)分界較明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰（圖4～圖9）。

圖4 空白組小鼠胸腺（HE，40×）Fig.4 Thymus of mouse in control group（HE，40×）

圖5 模型組小鼠胸腺 （HE，40×）Fig.5 Thymus of mouse in model group（HE，40×）

圖6 高劑量TAP組小鼠胸腺 （HE，40×）Fig.6 Thymus of mouse in high dose TAP group（HE，40×）

圖7 空白組小鼠胸腺皮髓質(zhì)交界處（HE，400×）Fig.7 The juncture between thymus medulla and cortex of mouse in control group（HE，400×）

圖8 模型組小鼠胸腺皮髓質(zhì)交界處 （HE，400×）Fig.8 The juncture between thymus medulla and cortexof mouse in model grup（HE，100×）

圖9 高劑量TAP組小鼠胸腺皮髓質(zhì)交界處（HE，400×）Fig.9 The juncture between thymus medulla and cortex of mouse in high dose TAP group（HE，400×）

3 討論

脾臟是最大的外周免疫器官，主要由白髓和紅髓組成，白髓中的淋巴小結(jié)為B細(xì)胞居留區(qū)而其附近的動脈周圍淋巴鞘則為T細(xì)胞居留區(qū)，當(dāng)發(fā)生細(xì)胞免疫反應(yīng)時，動脈周圍淋巴鞘將會增厚，而發(fā)生體液免疫時，脾小結(jié)將增大。鄭素玲等［9］研究表明，免疫功能低下的衰老小鼠的組織學(xué)特點(diǎn)是脾臟白髓和紅髓間界限不清，白髓所占比例減少，脾小結(jié)不明顯。本試驗(yàn)以CTX引起脾臟和胸腺萎縮時，可發(fā)現(xiàn)動脈周圍淋巴鞘變薄，脾小結(jié)以及白髓顯著縮小，表明CTX可同時造成小鼠T和B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少進(jìn)而引起小鼠細(xì)胞及體液免疫功能的降低。據(jù)報道，多糖類物質(zhì)可通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，巨噬細(xì)胞吞噬能力，免疫細(xì)胞因子表達(dá)，血清抗體水平等途徑來增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［10-13］。研究表明，TAP可顯著促進(jìn)健康小鼠的免疫器官發(fā)育，增加其免疫器官指數(shù)，并可單獨(dú)或協(xié)同ConA及LPS促進(jìn)脾臟細(xì)胞增殖［6］，這可能是TAP拮抗CTX造成的免疫器官萎縮的重要原因。王青等［14］采用流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫抑制小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的變化發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著降低，使T淋巴細(xì)胞比率顯著升高，表明CTX對單核細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞的殺傷作用較大。本試驗(yàn)通過觀察組織切片也發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠脾臟紅髓邊緣區(qū)中的B細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，而TAP可使免疫抑制小鼠脾臟紅髓及白髓區(qū)的細(xì)胞數(shù)量顯著增多，表明TAP可促進(jìn)淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞增殖。

正常的胸腺髓質(zhì)中淋巴細(xì)胞數(shù)量較少，而上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞數(shù)量較多且形態(tài)多樣，這些網(wǎng)狀細(xì)胞能分泌胸腺素，以促進(jìn)骨髓干細(xì)胞分化成T淋巴細(xì)胞，大部分形成的T淋巴細(xì)胞又將被胸腺中的上皮網(wǎng)狀細(xì)胞網(wǎng)眼內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬。試驗(yàn)表明，模型組胸腺髓質(zhì)中淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，這可能與髓質(zhì)中巨噬細(xì)胞大量減少有關(guān)，提示CTX可通過抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能而降低機(jī)體的細(xì)胞免疫能力。研究表明，TAP可促進(jìn)正常小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能［6］。在高劑量TAP組的胸腺髓質(zhì)中淋巴細(xì)胞數(shù)量比模型組顯著減少，而皮質(zhì)中淋巴細(xì)胞數(shù)量則顯著增多，表明了TAP對髓質(zhì)中巨噬細(xì)胞的數(shù)量及吞噬能力有明顯的提高，還能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。

試驗(yàn)結(jié)果表明，TAP可拮抗CTX引起的免疫器官損傷，其部分機(jī)制可能是TAP可直接促進(jìn)組織中淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增殖，這將有利于維持免疫器官的正常結(jié)構(gòu)和功能，而TAP對免疫抑制小鼠的免疫功能調(diào)節(jié)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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