郭利英

（內蒙古烏蘭察布職業(yè)學院新校區(qū)生物技術系，內蒙古烏蘭察布012000）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的以感染禽類為主的一種急性、高度接觸性傳染病，是威脅養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一［1-2］。新城疫呈世界性流行，各國都十分重視該病，經過幾十年的努力，世界各國基本將該病控制住，但從近些年的調查研究中可以看到，我國的新城疫大規(guī)模流行已得到基本控制，但新城疫仍未從根本上杜絕，在部分地區(qū)仍時常散發(fā)，而且癥狀與病變呈非典型性［3］，有的病程呈慢性經過，給養(yǎng)殖業(yè)帶來很大損失［4］，分析其可能原因之一是與強毒不斷從外界引入有關。已有研究表明，許多禽類如鴿［5］、麻雀［6］等對NDV也有易感性，可以作為保毒宿主甚至作為傳染源，它們在一定范圍內的活動可以將疫區(qū)的NDV強毒引入雞群，使雞場不斷受到野外強毒威脅。我國是一個養(yǎng)雞大國，養(yǎng)雞在農村甚為普遍，是農民一項重要經濟來源，但是由于交通、技術等原因，長期以來這些地區(qū)成為免疫薄弱區(qū)，特別在偏遠村落，往往不按合理的免疫程序和免疫方法操作，甚至不用疫苗免疫接種，這樣的雞群一旦侵入強毒則呈典型暴發(fā)，造成極大的損失［7］。因此，本研究的目的就是了解近年來內蒙古烏蘭察布地區(qū)新城疫的流行現狀，研究流行毒株的常規(guī)生物學特性，分析該病的流行趨勢，為新城疫有效診斷和控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料采自內蒙古集寧地區(qū)2個養(yǎng)雞場中病死雞的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟等組織。

1.1.2 參考毒株及陽性血清 NDV標準強毒株F48E9和弱毒株La Sota，由內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院預防獸醫(yī)學教研室傳染病組保存；NDV陽性血清和禽流感病毒（AIV）陽性血清（H5N1），由內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院預防獸醫(yī)學教研室傳染病組提供。

1.1.3 實驗動物 SPF種蛋由天津瑞普生物制藥廠提供，9日齡～10日齡SPF雞胚，用SPF種蛋在實驗室內用消毒好的孵化器孵化。1日齡SPF雛雞，用SPF種蛋在實驗室內用消毒好的孵化器孵化分組飼養(yǎng)于消毒的動物房內。6周齡雞，用SPF種蛋在實驗室內用消毒好的孵化器孵化，非新城疫疫苗免疫，分組飼養(yǎng)于消毒的動物房內。健康馬、牛、羊、雞、兔紅細胞由內蒙古農業(yè)大學實驗動物院提供。人O型新鮮血液由內蒙古中心血站提供。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理 分別取不同雞場病死雞的腦組織放入消毒好的試管中，用吸管或玻璃棒研磨后加入滅菌生理鹽水配成1∶10組織混懸液，經過3次凍融，離心10min（2 000r／min～3 000r／min），之后取上清液加青霉素、鏈霉素使其濃度為1 000單位／mL，4℃過夜后置-20℃保存。

1.2.2 雞胚接種傳代 取9日齡～11日齡SPF雞胚，用1mL注射器吸取處理好的病料接種9日齡～11日齡SPF雞胚（0.1mL／枚），用石蠟封閉接種孔。同時以3枚雞胚接種0.1mL／枚滅菌生理鹽水作對照，然后于37℃的恒溫箱內孵育，將24h內的死胚棄去，24h～96h的死胚及96h存活胚置4℃過夜后觀察雞胚病變，同時無菌采集尿囊液，-20℃保存。

1.2.3 血凝和血凝抑制試驗 按常規(guī)微量法（25μL）［4］測定無菌收集尿囊液的血凝價，再用 NDV陽性血清和AIV陽性血清進行血凝抑制試驗。

1.2.4 血清中和試驗 將2個分離株第3代的雞胚尿囊液分別用滅菌生理鹽水稀釋1 000倍，各取1 mL病毒稀釋液分別與等量10倍稀釋的新城疫標準陽性血清和AIV標準陽性血清充分混均后于37℃作用1h，同時設置上述滅菌生理鹽水稀釋1 000倍尿囊液作為對照組，每組接種10日齡雞胚5只，每胚0.1mL，37℃孵育，接種后每天照蛋2次～4次，死胚隨時拿出，連續(xù)照蛋7d，活胚置于4℃冰箱凍死測定所有雞胚尿囊液的血凝價。

1.2.5 紅細胞凝集譜的測定 分別取雞、牛、羊、兔、馬及人O型新鮮血液配置成10mL／L的紅細胞，對不同雞場分離的NDV毒株和弱毒株La Sota尿囊液做血凝試驗，測定各毒株對不同動物紅細胞的凝集力。

1.2.6 毒株毒力測定

1.2.6.1 致死雞胚平均死亡時間（MDT）的測定

JN1和JN2株NDV雞胚尿囊液用無菌生理鹽水（含青霉素和鏈霉素）按10倍系列稀釋，每個稀釋度分別接種10日齡的SPF 8枚（0.1mL／枚）。37℃孵化，棄去24h內死胚，每天照蛋4次，連續(xù)觀察7 d。同時設滅菌生理鹽水接種作正常對照。觀察雞胚死亡情況，剖檢死亡雞胚，最后按公式計算出致死雞胚平均死亡時間（MDT）［8］。

1.2.6.2 對1日齡易感雛雞腦內接種致病指數（ICPI）的測定 參照文獻［9］，JN1和JN2株 NDV的雞胚尿囊液用無菌生理鹽水進行10-1稀釋，給10只出殼后36h內的雛雞進行腦內接種，同時以6只雛雞腦內接種無菌生理鹽水（含青霉素和鏈霉素）作對照，0.05mL／只，隔離飼養(yǎng)。每隔24h觀察并記錄雞群的情況，進行評定，死雞按2分記，發(fā)病雞按1分記，正常雞按0分記，連續(xù)進行8d觀察。最后按公式求出ICPI。

1.2.6.3 對6周齡非免疫雛雞靜脈接種致病指數（IVPI）的測定 JN1和JN2株NDV雞胚尿囊液用滅菌生理鹽水作10-1稀釋，每個毒株分別給10只6周齡非免疫雛雞（0.1mL／只）翅靜脈接種，并取4只，每只接種0.1mL滅菌生理鹽水，作為正常對照組，隔離飼養(yǎng)。接種后，每隔24h對雞群健康情況進行檢查，連續(xù)觀察10d，根據每日雞群的健康情況記分，正常雞只按0分記，發(fā)病雞只按1分記，麻痹雞只按2分記，死亡雞只按3分記，設置對照雞5只。按公式計算IVPI。

2 結果

2.1 毒株的分離和血凝試驗結果

病料接種雞胚后雞胚大多在26h～78h死亡，死亡雞胚尿囊液較清亮，全身都有出血現象，頭、頸、腹部以及爪最嚴重，HA滴度為1∶16～1∶528。初代培養(yǎng)物盲傳2代后雞胚死亡時間逐漸規(guī)律，血凝價上升2個滴度。分離株分別命名為JN1和JN2。分離株接種雞胚后雞胚死亡情況及HA測定結果如表1。

表1 分離株接種雞胚后雞胚死亡情況及HA測定結果Table 1 The chicken embryo death and HA assay results of isolates after inoculation

2.2 血凝抑制試驗結果

分離株尿囊液均可凝集SPF雞的紅細胞，初代培養(yǎng)物HA滴度為1∶16～1∶528，盲傳2代后，血凝價可上升2個滴度。HA價在1∶32～1∶1 024，2個分離株可被NDV標準強毒株陽性血清所抑制，不被AIV陽性血清所抑制，分離株HI試驗結果如表2。

2.3 血清中和試驗結果

接種NDV標準陽性血清中和組的雞胚全部健活，且雞胚尿囊液無血凝性，而AIV陽性血清中和組和生理鹽水稀釋的1 000倍尿囊液作為對照組接種的雞胚全部死亡，其死亡雞胚尿囊液均有血凝性。

2.4 紅細胞凝集譜的測定結果

分離毒株對不同動物紅細胞的凝集作用不一樣，兩個分離毒株對馬、牛、羊、兔紅細胞的凝集價較低，而對雞及人O型紅細胞的凝集價較高。分離毒株對不同動物紅細胞的凝集譜測定結果見表3。

2.5 分離毒株毒力測定結果

2.5.1 MDT測定的結果 2株NDV全部致死雞胚的最高稀釋度分別為10-7和10-7。對雞胚進行觀察，死亡雞胚全身有明顯的出血，其中頭及四肢較嚴重，未死亡的雞胚部分有出血現象，但不太明顯。對照組8只雞胚都正常。JN1和JN2的MDT結果分別為40.5h和43.5h。

2.5.2 ICPI測定結果 2株毒株接種后雛雞表現的癥狀相似，主要為食欲下降，嗜睡，翅垂地，后期出現廢食，跛行，一肢或兩肢麻痹癱瘓，呼吸困難，甩頭扭脖子，2d～3d后出現死亡，剖檢后直腸后端有大量的水樣糞便及白色尿酸鹽，有的出現腺胃潰瘍，肺水腫，腦內化膿，并有少量的炎性滲出物。JN1和JN2的ICPI結果分別為1.86和1.85。

2.5.3 IVPI測定結果 2株毒株接種后癥狀表現相似，主要為精神萎頓，打堆，嗜睡，有的咳嗽，氣喘，糞便稀軟發(fā)白，食欲減退，耷拉翅膀，部分有轉圈運動，后期表現食欲廢絕，雞冠和肉髯發(fā)紫，張口呼吸，發(fā)出“呼?！甭暎信ゎ^動作，部分口流黏液。2d～3 d出現死亡，剖檢可見個別膽囊充盈，脾臟有白色小點狀壞死灶，腺胃黏膜乳頭常有大小不一的出血點，小腸、大腸的黏膜充血或出血，盲腸扁桃體腫大、出血和壞死，喉頭有出血點等。JN1和JN2的IVPI結果分別為2.38和2.69。

表2 分離株HI試驗結果Table 2 HI test results of isolates strains

表3 分離毒株紅細胞凝集譜Table 3 The erythrocyte agglutination spectrum of isolate strains

3 討論

從發(fā)病地區(qū)毒株的分離和血凝試驗結果上看，分離株JN1和JN2尿囊液均可凝集SPF雞的紅細胞，初代培養(yǎng)物HA滴度為1∶16～1∶528。盲傳2代后，血凝價可上升2個滴度。HA價在1∶32～1∶1 024。2個分離株可被NDV標準強毒株陽性血清所抑制，不被AIV陽性血清所抑制。接種NDV標準陽性血清中和組的雞胚全部健活，且雞胚尿囊液無血凝性，而AIV陽性血清中和組和生理鹽水稀釋的1 000倍尿囊液作為對照組接種的雞胚全部死亡，其死亡雞胚尿囊液均有血凝性。說明分離的病毒為新城疫病毒而且感染雞胚血凝價很高。分離毒株對不同動物紅細胞的凝集作用不一樣，2個分離毒株對馬、牛、羊、兔紅細胞的凝集價較低，而對雞及人O型紅細胞的凝集價較高。這與孫靜等［10］結果一樣。薛俊龍［11］報道新城疫病毒一般對馬和豬的紅細胞不凝集，但有個別弱毒株可以凝集馬的紅細胞。

有資料報道，衡量NDV毒力強弱的常用方法是進行新城疫病毒的MDT、ICPI和IVPI的測定。一般認為強毒株的MDT＜60h，ICPI＞1.5；中等毒力毒株的 MDT為60h～90h，ICPI為0.6～1.5；弱毒株的 MDT＞90h，IVPI＜0.6。IVPI作為參考，強毒株的IVPI常大于2.0［12］。將我們分離的毒株測得的ICPI、MDT結果與之進行比較，證明該分離毒株JN1、JN2屬NDV強毒型。

在高強度的免疫壓力下新城疫得到了較好的控制，但近些年來，新城疫出現了一些新的情況，在免疫過的雞群中即使能產生高的抗體滴度，新城疫仍時有暴發(fā)，已成為威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展最嚴重的疾病之一［13］。按照傳統(tǒng)經驗診斷難度大，容易延誤最佳治療時機，實驗室檢測是確診該病的關鍵。隨著疫病的流行，養(yǎng)殖戶大量使用抗生素，導致雞群耐藥性增強，傳統(tǒng)疫苗對流行NDV毒株的預防效果不斷減弱，因此，研發(fā)新型高效疫苗，制定合理的防控措施，是迫在眉睫的大事。

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