倪孟祥，胡 穎

（中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院，江蘇 南京210009）

從海洋微生物尋找新藥已成為開發(fā)藥物資源的重要策略之一［1，2］。國內(nèi)外對海洋細菌和放線菌的活性天然產(chǎn)物的研究起步較早，發(fā)現(xiàn)的新化合物數(shù)量也較多，相比之下對海洋真菌的系統(tǒng)研究起步較遲，直到20世紀90年代才進入較快速的發(fā)展階段［3］。目前，人們已經(jīng)從海洋真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了1000多種新的次生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗菌、抗病毒等生物活性，成為當前海洋藥物研究的熱點［4，5］。

作者從北極海泥中分離真菌，采用其發(fā)酵液進行抗菌活性篩選，并鑒定其種類、研究其活性代謝產(chǎn)物的性質(zhì)，以期發(fā)現(xiàn)具有顯著抗菌活性的菌株，為建設海洋真菌種質(zhì)資源庫、開發(fā)新的微生物藥物奠定基礎。

1 實驗

1．1 材料

1．1．1 樣品來源

北極海泥來自北極黃河站附近海域潮間帶。

1．1．2 指示菌

金黃色葡萄球菌 （Staphyloccus aureus）ATCC 25925、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、多株金黃色葡萄球菌臨床分離耐藥菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、白色念珠菌（Candida albicans），均由中國藥科大學微生物學實驗室提供。

1．1．3 主要試劑

DNA Marker、Taq MasterMix，康為；引物由上海生工合成；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．2 培養(yǎng)基

1．2．1 分離培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮，200g切成小塊，加水煮沸30min，4～6層紗布過濾，加20g葡萄糖、20g海鹽、15～20g瓊脂，蒸餾水1000mL。

察氏培養(yǎng)基：NaNO32g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0．5g，KCl 0．5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0．01g，蔗糖30g，海鹽20g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL。

沙氏培養(yǎng)基：蛋白胨10g，葡萄糖4g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL。

改良的馬丁培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉2g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0．5g，海鹽20g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL。

葡萄糖酵母膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母膏0．5g，海鹽20g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL。

1．2．2 指示菌培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL。

1．2．3 發(fā)酵培養(yǎng)基

種子發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：察氏液體培養(yǎng)基。

1．3 方法

1．3．1 菌株的分離

采用平板稀釋法分離菌株。取海泥樣品1g，用無菌海水逐級稀釋至10－1、10－2、10－3、10－4、10－5數(shù)量級，各取0．2mL均勻涂布于分離平板上，每個稀釋度涂3個平板，28℃倒置培養(yǎng)，每天觀察是否有新菌落出現(xiàn)，挑取形態(tài)相異的菌落劃線純化，純化的菌株斜面置于4℃冰箱保存。

1．3．2 菌株發(fā)酵液的制備

從活化斜面中取菌絲塊或孢子接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，28℃、200r·min－1下培養(yǎng)3d作為種子。將種子以8%的接種量接入裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，28℃、200r·min－1下培養(yǎng)7d。將發(fā)酵液用低溫高速離心機8000r·min－1離心20min，取上清布氏漏斗抽濾，得到澄清發(fā)酵液，用無菌的0．22μm濾膜過濾，得無菌體的澄清發(fā)酵液，4℃冰箱保存。

1．3．3 菌株發(fā)酵液體外抗菌實驗［6］

采用濾紙片法進行抗菌實驗。用無菌水將斜面培養(yǎng)的指示菌洗下，與適量培養(yǎng)基混勻倒平板，將含有待測樣品的無菌濾紙片貼于平板上，細菌培養(yǎng)24h，真菌培養(yǎng)48h，觀察是否有清晰透明的抑菌圈產(chǎn)生，并測量抑菌圈的直徑大小。

1．3．4 菌株 H5的鑒定

1．3．4．1 培養(yǎng)特征觀察

采用標準條件培養(yǎng)菌株，觀察并記錄PDA平皿菌落特征，包括菌落的正背面顏色、菌落直徑、菌落質(zhì)地、有無分泌物等。

1．3．4．2 顯微形態(tài)觀察

挑取菌株產(chǎn)孢器及菌絲制成水封片，呂氏堿性美藍染色，進行鏡下觀察，記錄菌絲特征及分枝情況、孢子和產(chǎn)孢器結(jié)構(gòu)等。

1．3．4．3 ITS序列分析

采用改良的CTAB法提取基因組DNA［7］。

ITS序列的PCR擴增采用通用引物：ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和 ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）。PCR 擴 增 條 件：95℃ 預 變 性4min，95 ℃ 30s，55 ℃ 40s，72 ℃1min，循環(huán)30次，72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測，純化后交南京思普金公司測序。

將測序得到的ITS序列通過Blast與GenBank中的核酸序列進行比對，利用 BioEdit 7．0．9．0及Mega 5．0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用鄰接法（Neighborjoining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進行自舉分析（Bootstrap），Bootstrap檢驗值≥50%（1000次重復），估算其內(nèi)分支的支持率。

1．3．5 菌株H5發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)的理化性質(zhì)初步研究

1．3．5．1 活性物質(zhì)對溫度、pH 值的穩(wěn)定性實驗［8］

將發(fā)酵液12等分，分別調(diào) pH 值至1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0、10．0、11．0、12．0，再將各份5等分，分別置于4℃、40℃、60℃、80℃及100℃水浴1h，各樣品以不同pH值水溶液和原發(fā)酵液為對照進行體外抗菌實驗，觀察抑菌效果。

1．3．5．2 活性物質(zhì)的萃取實驗［9］

將發(fā)酵液12等分，分別調(diào)pH 值至1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0、10．0、11．0、12．0，再將各份6等分，分別加入等體積的乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙酸丁酯、石油醚及正丁醇，4℃靜置，待完全分層后分別取有機相和水相，水相將pH值調(diào)回中性后同有機相均以原發(fā)酵液為對照進行抑菌實驗，觀察抑菌效果。

1．3．6 菌株H5發(fā)酵液活性物質(zhì)的提取

將發(fā)酵液調(diào)pH值2．0，過濾，除去不溶性雜質(zhì)，然后過已預處理的大孔離子交換樹脂D380，去除大部分色素及雜質(zhì)，收集洗滌液，接著用大孔吸附樹脂HPD300吸附，再用50%乙醇洗脫，分部收集洗滌液、洗脫液，測定不同洗滌液、洗脫液的活性，將有活性的部分合并，減壓濃縮成膏狀物，即得活性物質(zhì)的脫鹽粗提物。

1．3．7 粗提物的薄層層析（TLC）

將粗提物溶于少量甲醇中，在硅膠G板（20cm×15cm）上點樣，篩選后選用正己烷－正丁醇（4∶1）為展開劑，展層后干燥，在245nm的紫外燈下觀察，并用10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色。

2 結(jié)果與討論

2．1 菌株的分離及活性篩選

本實驗選用添加鏈霉素的5種不同的培養(yǎng)基從北極海泥樣品中共分離得到17株真菌。對這17株真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行抗菌活性初步篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株H5、H6對一種或幾種指示菌有抗菌活性。其抑制6種指示菌的能力比較見表1。

從表1可以看出，菌株H5的抗菌活性較強且抗菌譜較廣，且對多株金黃色葡萄球菌臨床分離耐藥菌煙曲霉屬的菌株相似度較高，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。有較好的抑制作用，因此選取H5進行后續(xù)研究。

表1 活性菌株的抗菌作用Tab．1Antimicrobial activity of the active marine fungus

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的N－J樹Fig．3 The neighbor－joining tree based on ITS rDNA sequences

2．2 菌株H5的鑒定結(jié)果

2．2．1 形態(tài)學鑒定

菌株H5在PDA平板上生長速度較快，培養(yǎng)7d后，菌絲蔓延至整個平板；菌落中心灰藍色，外緣白色，反面鮮黃色；菌落呈圓形，正面扁平且中心略微突起，邊緣呈樹枝狀，產(chǎn)鮮黃色色素；質(zhì)地疏松，絨毛狀，無明顯紋飾（圖1）。生物電鏡下觀察菌絲具橫隔，無分枝；分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，呈半球形，頂端著生成串的球形分生孢子（圖2）。根據(jù)其形態(tài)特征初步鑒定為煙曲霉屬（Aspergillus fumigatus）。

2．2．2 ITS序列分析

PCR擴增得到的菌株H5的ITS序列全長為557bp。將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的真菌ITS序列進行Blast分析，結(jié)果表明，菌株H5的ITS序列與

由圖3可知，菌株H5與煙曲霉屬Aspergillus fumigatus isolate 13－F2處于同一分支，親緣關系最近，同源性達到99%，因此可以確定菌株H5屬于煙曲霉屬。

2．3 菌株H5發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)的理化性質(zhì)

2．3．1 pH值及溫度對發(fā)酵液抗菌活性的影響（圖4）

圖4 pH值及溫度對菌株H5發(fā)酵液抗菌活性的影響Fig．4 Effects of pH value and temperature on the antibacterial activity of strain H5′s broth

由圖4可知，菌株H5發(fā)酵液在酸性至中性條件下抗菌活性較高且性質(zhì)較穩(wěn)定（不同pH值水溶液、對照均無抑菌圈形成，排除因pH值不同對實驗結(jié)果造成干擾的可能）。pH值1～5的發(fā)酵液沸水浴l h后抗菌活性幾乎不變。但在堿性條件下其抗菌活性明顯減弱，pH＞8時喪失抗菌活性，表明抗菌物質(zhì)可能在堿性條件下被破壞。

2．3．2 活性物質(zhì)萃取實驗結(jié)果

通過觀察萃取后各樣品形成的抑菌圈的大小，發(fā)現(xiàn)菌株H5的發(fā)酵液只有在酸性至中性條件下才能被有機溶劑萃取，在乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙酸丁酯、石油醚、正丁醇萃取液中有不同濃度活性物質(zhì)存在（見圖5），正丁醇的萃取效果相對最好，說明活性物質(zhì)極性較大。

2．4 發(fā)酵液中活性成分的初步分離提純結(jié)果

圖5 不同pH值條件下抗菌活性物質(zhì)在不同有機溶劑中的溶解量Fig．5 Partition of the antibiotics of strain H5in the organic solvents under different pH values

發(fā)酵液的粗提物經(jīng)硅膠G薄層層析后，通過10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色可觀察到4個斑點。經(jīng)活性檢測后發(fā)現(xiàn)其中1個斑點（Rf＝0．4）具有較強的抗菌活性，且與其它斑點之間的分離度良好（表2），為后續(xù)分離純化工藝奠定了基礎。

表2 活性物質(zhì)粗提物的薄層層析Tab．2 TLC of the crude extract with antimicrobial activity

3 結(jié)論

從北極海泥中分離篩選抗菌活性海洋真菌，共分離得到真菌17株，其中菌株H5、H6的發(fā)酵液具有較好的抗菌活性，菌株H5的活性更強。根據(jù)菌株的形態(tài)學特征和ITS序列分析結(jié)果，鑒定菌株H5屬煙曲霉屬（Aspergillus fumigatus）。菌株H5的發(fā)酵液對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌均有良好的抑制活性，尤其是對耐甲氧西林及苯唑西林的金黃色葡萄球菌有很強的抑制作用，具有很好的研究應用前景。此外，該菌株抗菌代謝產(chǎn)物為極性較大、熱穩(wěn)定性較好、耐酸不耐堿的物質(zhì)。采用弱極性大孔樹脂分離活性物質(zhì)，薄層檢測發(fā)現(xiàn)，有1個活性組分有較強的抗菌活性。后期擬進一步分離純化菌株H5代謝產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，對其展開深入的研究，以期發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的天然抗菌化合物。

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