郎偉超 張麗

(南京理工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院 江蘇南京 210094)

酶的共價(jià)結(jié)合固定化是通過共價(jià)鍵把酶連接到帶有惰性基團(tuán)或者活性基團(tuán)的載體上。共價(jià)結(jié)合法已經(jīng)成為酶固定化的最主要的方法之一。其原理非常簡單,用預(yù)先設(shè)計(jì)好的,帶有活性基團(tuán)的不溶性載體,在適宜的條件下與氨基酸發(fā)生反應(yīng),形成共價(jià)鍵。

20世紀(jì)60年代,研究發(fā)現(xiàn),預(yù)先制備好的載體不僅僅是作為支撐酶的骨架,還可以使酶的性質(zhì)(如穩(wěn)定性、活力和選擇性)發(fā)生改變。

1 活性載體的合成

活性載體是指具有活性基團(tuán),在適當(dāng)條件下,能直接與酶結(jié)合的聚合物。因此,聚合物中應(yīng)該至少有一種單體含有活性基團(tuán),該基團(tuán)可以與酶中氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)。

1.1 含?；B氮的聚合物

含?；B氮的聚合物可以通過化學(xué)修飾直接制備得到。聚丙烯酰胺(PAAm)或者其他帶有酰肼基團(tuán)的聚丙烯酸都可以活化,使其連接活性?；B氮來結(jié)合酶。

2010年孔黎春、胡潔玲等人[1]在氟甲磺酸鋅的催化下合成?；B氮化合物。在三氟甲磺酸鋅催化下,由?；讲⑷蚺c疊氮化鈉,發(fā)生酰化反應(yīng)。該方法的原料易制備保存、反應(yīng)速度快、產(chǎn)率高、產(chǎn)物分離簡單。

但是,?；B氮可以同很多氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng),使酶可以通過不同的連接方式固定,而且固定化后酶活力較差。因此,這類聚合物很少被用于酶的固定化。

1.2 含酸酐的聚合物

含有酸酐基團(tuán)的聚合物是第二種被用于共價(jià)固定化的化合物?？梢酝ㄟ^帶有酸酐(檸檬酸酐、甲基丙烯酸酐、馬來酸酐)的單體在一定條件下直接聚合成共聚物或者均聚物。這種方法可以通過改變單體或者交聯(lián)劑來構(gòu)建具有不同結(jié)構(gòu)的載體,而且可以調(diào)節(jié)載體的疏水性能。

2010年,鄭建國、張松平等[2]用靜電紡絲法制備聚乙烯馬來酸酐共聚物納米材料。在聚合物濃度0.35g/mL,針尖到接收板距離為25cm,電紡液流量250μL/h,電壓12kV條件下,獲得了直徑300nm且分布均勻的納米材料。

但是帶有酸酐基團(tuán)的聚合物所帶的電荷會(huì)導(dǎo)致酶的水解反應(yīng)和疏水反應(yīng);載體所帶有的羧基會(huì)使固定化酶的最適作用pH增加1-2.5個(gè)單位。此外,對于顆粒狀的載體,其表面積較小。

1.3 帶有鹵素原子的聚合物

1970年,Brown進(jìn)行了鹵素置換反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)酶不僅可以在緩沖液中進(jìn)行固定,還可以在含水量低的有機(jī)溶液中固定。

2002年,Bahar等人[3]用無孔的聚對甲基苯乙烯(PCMS)通過PEI與載體連接,制備能承載0.019轉(zhuǎn)化酶的載體。其內(nèi)部擴(kuò)散阻力很小,可忽略不計(jì),而且固定化酶的熱穩(wěn)定性是游離酶的5倍。

1.4 聚碳酸酯

自20世紀(jì)70年代開始,聚碳酸酯就已經(jīng)被用于固定化酶。但是在此后的20年里,機(jī)會(huì)沒有這類聚合物被用于固定化酶的報(bào)道。

黃家賢等人[4]以乙烯撐碳酸酯為聚合單體,以親水性N,N’-亞甲基爽烯酰胺為交聯(lián)劑,分別用N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸-β-羥已酯兩種親水性單體作為酶載體的成分,通過反相懸浮聚合,合成了兩種性能較好的載體,它們夠快速與酶反應(yīng),并且酶活力良好。

Ding LH等人發(fā)現(xiàn),聚碳酸酯是可溶性的均聚物,通過交聯(lián)可以得到不溶性的球狀載體,可以用于固定胰蛋白酶。酶的固定量達(dá)到0.25。但是,酶的活力回收率卻低于15%。原因可能是反應(yīng)基團(tuán)的密度升高或者是擴(kuò)散阻力增大而導(dǎo)致酶的活力下降。濕載體的最大固定化量為0.025。

1.5 帶有乙?；木酆衔?/h3>

Slotmkowski通過含乙?；膯误w聚合制備了醛基聚合物載體,該載體包含由丙烯醛合成的聚丙烯醛,聚丙烯醛是可溶于水的4-乙烯基嘧啶與丙烯醛的共聚物,該載體被用于乙醇脫氫酶和NADH的固定化。

目前,使用帶乙?；木酆陷d體固定化酶的方法正漸漸失去重要性,這不僅僅是因?yàn)镾chiff堿連接的不穩(wěn)定性,更是因?yàn)楹┗木酆衔锔菀淄ㄟ^基團(tuán)互變技術(shù)得到。

1.6 苯酚聚合物

苯酚聚合物通常具有成本低、親水性、易于制備等特點(diǎn)。較為常用的是鄰苯二酚或者對苯二酚與戊二醛或者甲醛縮合反應(yīng)。這類多空載體可以用于多種酶的固定化,例如:磷酸酯酶、卵清蛋白。

2 展望

載體在酶固定化技術(shù)中占有舉足輕重的地位,具有優(yōu)良的性能的載體能夠?qū)Υ蠓岣呙腹潭ɑЧ?因此,在固定化酶的過程中選擇制備合適的的載體是非常重要的。近年來,隨著化學(xué)、材料等技術(shù)的發(fā)展,固定化技術(shù)也得到了迅速發(fā)展,特別是共價(jià)結(jié)合的載體材料研究也取得了很大進(jìn)展,并且有向精細(xì)化發(fā)展的趨勢。因此,在對傳統(tǒng)載體材料改進(jìn)的同時(shí),開發(fā)新型改性復(fù)合載體將成為今后研究的重點(diǎn)。

[1]孔黎春,胡潔玲,張龍峰.三氟甲磺酸鋅催化下?；B氮化合物的合成[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào),2010,33(2):185-188.

[2]鄭建國,張松平,張羽飛.靜電紡絲制備苯乙烯馬來酸酐共聚物納米纖維及其固定化β-D-半乳糖苷酶[J].過程工程學(xué)報(bào),2010,10(4):743-749.

[3]Bahar T,Tuncel A.Immobilidation of invertase on to crosslinked poly(pchloromethylstyrene) beads[J].Appl Polym Sci,2002,83:1268-1279.

[4]黃家賢,霍巖麗,李涵,等.含環(huán)碳酸酯基固定化酶載體的合成及其性能研究[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2001,17(3):377-380.