張洪征 程治軍 萬建民

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 農(nóng)作物基因資源和基因改良國家重大科學(xué)工程，北京 100081）

白化（albino）是常見的植物葉色突變類型，嚴(yán)重影響光合效率，造成植物的減產(chǎn)甚至死亡。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［1］、水稻（Oryza sativa）［2］、煙草（Nicotiana tabacum）［3］、大麥（Hordeum vulgare）［4］、小麥（Triticum aestivum）［5］和玉米（Zea mays）［6］中都有研究報道。根據(jù)Gustaftsson的分類標(biāo)準(zhǔn)，水稻白化突變體大體上分成白化型、條紋葉型和斑點型3種。根據(jù)突變性狀對個體生長發(fā)育的影響，水稻葉色突變可分為致死突變和非致死突變。本文中所說的白化突變體主要指非致死突變體。

目前報道的水稻葉色突變體中，白化類型至少40種，黃化類型至少26種，這兩種類型的突變體也就成為了研究的熱點。與黃化相比，白化突變體在苗期的表型受到環(huán)境等因素的影響更小，容易鑒定，在圖位克隆以及后續(xù)的互補驗證等方面具有很大的優(yōu)勢［7］。

1 水稻白化突變體的來源

葉色突變體的來源非常廣泛，一般可劃分為自發(fā)突變、人工誘變兩大類。自發(fā)突變是自然條件下形成的突變，發(fā)生概率比較低。

張毅等［8］從秈稻G46B與意大利粳稻Sirio雜交后代中發(fā)現(xiàn)的白化轉(zhuǎn)綠突變體gra、張力科等［9］發(fā)現(xiàn)的水稻白條紋葉突變體wg206、李育紅等［10］發(fā)現(xiàn)的來自于遲熟粳稻品種－淮稻7號的白化突變體irl、Chen等［11］在粳稻中發(fā)現(xiàn)的QiuFeng（秋豐）M、賈銀華等［12］在（W9641S×W6154S）F1代花粉培養(yǎng)后代中發(fā)現(xiàn)的白化轉(zhuǎn)綠不育系白01S，以及鄧靜等［13］發(fā)現(xiàn)的光溫敏不育材料XGS等都是典型的自發(fā)突變體。

人工誘變主要包括物理誘變、化學(xué)誘變和基于基因操作導(dǎo)致的突變。物理誘變是利用電離輻射處理水稻種子或幼苗而產(chǎn)生突變體的方法。X射線、γ射線、紫外線、α及β粒子、質(zhì)子及中子等都是常用的電離輻射。陳善福等［14］用60Co-γ射線直接輻照龍?zhí)馗干種子獲得了包括白化轉(zhuǎn)綠在內(nèi)的6種葉色突變體。郭濤等［15］利用返回式衛(wèi)星搭載種子進(jìn)行太空輻射誘變，獲得了白化轉(zhuǎn)綠并且多分蘗矮稈的突變體hfa-1。另外，Su等［16］研究的ysa白化轉(zhuǎn)綠突變體是在輻射劑量300 Gy，劑量率5 Gy/min條件下誘變培矮64S產(chǎn)生的。Dong等［17］從粳稻品種“嘉花1號”60Co-γ射線輻照的后代中篩選到一個水稻溫敏感白化轉(zhuǎn)綠突變體tcm12。

化學(xué)誘變是利用誘變劑產(chǎn)生誘變的方法，目前最有效的誘變劑是烷化劑和疊氮化物。誘變劑的劑量由濃度、處理的時間及處理時的溫度決定。呂典華等［18］用化學(xué)誘變劑EMS（甲基磺酸乙酯）獲得了新的白化轉(zhuǎn)綠葉突變體。相同方法得到的突變體還有誘變中9B得到的白化轉(zhuǎn)綠突變體zjw、日本晴經(jīng)誘變后得到的白化轉(zhuǎn)綠突變體gra75。

基于遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得的主要包括T-DNA插入突變和轉(zhuǎn)座子插入突變等。Jung等［19］發(fā)現(xiàn)在 189個由單隱性基因控制的葉綠素缺乏突變體中有10個突變體的表型由T-DNA插入引起。Miyao等{20］建立了包括47 196個株系的Tos17插入突變體庫，其中存在白葉、黃葉、斑馬葉、條紋葉及斑點葉等多種類型的插入突變體。張澤民等［21］在篩選和鑒定水稻T-DNA（含Basta抗性基因）插入純合體的過程中發(fā)現(xiàn)了一個白化苗性狀突變體，它是由單拷貝T-DNA插入所引起的，與T-DNA共分離。楊轉(zhuǎn)英等［22］從水稻T-DNA轉(zhuǎn)化群體中篩選出的可轉(zhuǎn)綠白化株系也是這種類型的突變體植株。

2 水稻白化突變體的光溫敏感性

2.1 水稻白化表型多對溫度變化敏感

水稻白化突變體表型受溫度影響明顯。吳殿星等［23］把葉色突變體大致地分為高溫表達(dá)型、低溫表達(dá)型和溫鈍型3種。

在白化轉(zhuǎn)綠類型突變體中，（tsc-1）7436S［17］在23.1℃、26.1℃和30.1℃的梯度下，葉片呈現(xiàn)白色、淺綠、綠色的變化。水稻突變體w1［24］在30℃條件下表型正常，葉綠素和類胡蘿卜素含量與對照無顯著差異；但是低溫（15-20℃）下白化，葉綠素和類胡蘿卜素含量明顯較低；白化苗中葉綠素生物合成的中間產(chǎn)物鎂原卟啉、原葉綠素（酸）、原卟啉Ⅸ含量減少，而膽色素原和δ-氨基酮戊酸明顯積累。W25［25］在不同溫度下葉色變化顯著，較低溫度（≤25℃）下，幼葉完全白化，而在較高溫度（≥30℃）時，其第1-2葉卻表現(xiàn)為淺綠色和正常綠色。

在條紋類型中，gws也屬于典型的低溫表達(dá)型［26］；許鳳華［26］分別考查了 22℃、26℃和 30℃下幼苗葉片葉綠素含量。試驗結(jié)果顯示，3種條件下條紋突變體的葉綠素 a、葉綠素 b、總?cè)~綠素含量及胡蘿卜素的含量都低于野生型。突變體與野生型的相對葉綠素含量在 22℃時最低，僅為對照的27.5%。與gws不同，白色條紋突變體st10屬于高溫表達(dá)型［27］，溫度處理結(jié)果表明，32℃條件下白色條紋性狀較24℃和28℃條件下更明顯，突變體的葉色明顯變白，其中葉綠素a與葉綠素b的含量比野生型分別下降了17%和11%。而在24℃、28℃兩個溫度下處理突變體與野生型葉綠素含量差異不明顯。

2.2 水稻白化突變體的光敏感性

光照直接影響植物光合色素的合成以及相關(guān)酶的生物活性，從而影響植物的葉色和光合效率。李紅等［28］對苗期斑馬葉突變體b411進(jìn)行不同光強、光周期、光周期數(shù)的處理結(jié)果表明：光強大于300 μmol/m2/s是b411斑馬葉表達(dá)的必要條件；在光強1 000 μmol/m2/s，光期溫度32℃和暗期溫度22℃條件下，斑馬葉表達(dá)的臨界光長為3 h；在光周期為12 h/12 h的條件下，斑馬葉表達(dá)的臨界光長為48 h。斑馬葉突變體tcm248在光期溫度30℃/暗期溫度20℃下，只有光強大于40 μmol/m2/s時才能出現(xiàn)斑馬葉的表型，Dong等［17］因此推測斑馬葉的表型可能起源于葉片吸收過量的強光引起了光氧化，破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了葉片局部葉綠素含量降低。

3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

成熟的植物葉綠體最外面是具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的葉綠體膜，內(nèi)部由大量的基粒片層和充斥其中的流動基質(zhì)組成。葉綠體的發(fā)育按照時空的順序可以分成3個階段：第一個階段稱為前質(zhì)體時期，這個時期的生命活動主要在分生的細(xì)胞或分裂起始的細(xì)胞中進(jìn)行，細(xì)胞中沒有形成類囊體膜，主要進(jìn)行葉綠體的分化前準(zhǔn)備；第2個階段稱為單片層形成期，這個時候出現(xiàn)了前質(zhì)體類囊體內(nèi)膜，并且內(nèi)膜不斷凹陷，逐漸形成了獨立的類囊體片層；第3個階段稱為基粒形成期，類囊體片層按照一定的順序不斷疊加，形成排列整齊緊湊的基粒片層，葉綠體分化完成。葉綠體的分化是一個系統(tǒng)的過程，任何階段的缺陷都會造成葉綠體分化受阻。例如，fan5突變體因為其葉綠體沒有類囊體，只有與前質(zhì)體類似的泡狀結(jié)構(gòu)，這是典型的葉綠體分化第1階段受阻。有些基因也會影響葉綠體發(fā)育的其他階段，造成類囊體排列紊亂或者類囊體膜畸形［5，24］。李育紅、李超等［29，30］發(fā)現(xiàn)的白條斑點葉突變體，其白化部位細(xì)胞質(zhì)多含有嗜鋨小球聚積體，不含有正常的類囊體和基粒片層結(jié)構(gòu)。Kusumi等［31］對斑馬葉突變體的葉綠體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，葉片綠色部分的葉綠體結(jié)構(gòu)正常，而白色區(qū)域中的葉綠體類囊體膜系統(tǒng)紊亂；進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，突變體在24℃下，葉片白化部分不含葉綠體或者葉綠體的發(fā)育存在一些空囊泡結(jié)構(gòu)，類囊體基粒片層結(jié)構(gòu)不存在；在28℃條件下，極少部分細(xì)胞發(fā)育出正常的葉綠體，大部分細(xì)胞仍沒有葉綠體。王平榮等［32］發(fā)現(xiàn)，白化轉(zhuǎn)綠型突變體gra75在四葉期葉肉細(xì)胞中葉綠體數(shù)目減少，并且葉綠體形態(tài)發(fā)育不健全，類囊體片層、基粒和淀粉粒數(shù)目減少。

4 產(chǎn)生白化突變體的分子機理

4.1 葉綠素代謝途徑基因突變引起的白化轉(zhuǎn)綠突變

葉綠素代謝是一個復(fù)雜的酶促反應(yīng)，由20多個基因編碼的16種酶共同完成。葉綠素的合成有兩條主要分支，一條是形成葉綠素的鎂分支；另一條是合成亞鐵血紅素和光敏色素的鐵分支。Mg2+-螯合酶由ChlI、ChlD、ChlH 3個亞基組成，是水稻葉綠素合成過程鎂分支的關(guān)鍵酶，能夠催化原卟啉Ⅸ與Mg2+鰲合產(chǎn)生鎂原卟啉Ⅸ。Zhang等［33］發(fā)現(xiàn)ChlI、ChlD的點突變會使Mg2+-螯合酶的活性降低，編碼葉綠體核蛋白的基因表達(dá)停滯，葉綠素合成停止，產(chǎn)生白化。Fang等［34］發(fā)現(xiàn)水稻穗發(fā)芽突變體白化表型是由于葉綠素和類胡蘿卜素的缺失導(dǎo)致的；類胡蘿卜素在光合作用過程中作為輔助色素，能將吸收的光能傳遞給葉綠素a，是對葉綠素捕獲光能的補充，其生物合成途徑中的基因突變能導(dǎo)致葉片白化。Wu等［35］克隆的葉綠素合成相關(guān)基因ygl1以單拷貝的形式存在于水稻基因組中，編碼葉綠素合成酶，催化葉綠素酸酯植醇化，同時生成葉綠素a，這一合成步驟對葉綠素a輔基蛋白的翻譯和積累起重要作用，突變后降低了葉綠素合成酶的活性，延遲了葉綠素的合成。ysa突變體在3 葉期以前葉片白化，之后葉片逐漸變綠，到6 葉期完全恢復(fù)成正常綠色，ysa 可以作為一個早期標(biāo)記用于鑒定并去除假雜種，提高雜交稻的產(chǎn)量。Su等［16］證明ysa編碼一個含有16個串聯(lián)PPR（pentatricopeptide repeat）基序的三角狀五肽重復(fù)；PPR基因家族是高等植物中最大的基因家族之一，在調(diào)控植物細(xì)胞器基因的表達(dá)過程中發(fā)揮著重要作用。

葉綠素合成途徑以外的其他基因也會引起葉色變異。OsDVR編碼聯(lián)乙烯還原酶，可將聯(lián)乙烯葉綠素a轉(zhuǎn)化為單乙烯葉綠素a。在水稻中該基因突變體的葉綠體發(fā)育受到抑制，葉色白化，植株生長緩慢［36］。OsCAO1/2編碼葉綠素a加氧酶，是催化葉綠素a合成葉綠素b的關(guān)鍵酶。OsCAO1失活表現(xiàn)白化、矮化，嚴(yán)重時早衰死亡［37］。

4.2 葉綠體發(fā)育途徑基因突變引起的葉色突變

葉綠體的發(fā)育過程中遺傳物質(zhì)的代謝主要有3個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：第1個環(huán)節(jié)是遺傳物質(zhì)的積累，在這個階段葉片原基經(jīng)過分化成為分生組織，不斷的形成DNA等遺傳物質(zhì)，為遺傳信息的傳遞做準(zhǔn)備；第2個環(huán)節(jié)是遺傳物質(zhì)高效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，試驗檢測在這個時期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯的元件的表達(dá)，其表達(dá)量顯著提高；第3個環(huán)節(jié)是葉肉細(xì)胞的成熟，行使各項功能的蛋白基本分泌完成，能夠完整的行使葉綠體的功能。

Zhao等［38］在葉片近軸面白化的水稻突變體中克隆到一個基因Oschr4，Oschr4編碼葉綠體早期發(fā)育所必需的一個染色質(zhì)重構(gòu)因子；超微觀察表明突變部位的質(zhì)體生長或類囊體膜形成受阻，部分葉綠體早期發(fā)育和光合作用所需的基因的轉(zhuǎn)錄活性降低。水稻白化突變體v1、v2、v3苗期葉綠體發(fā)育受到抑制。v1編碼一個定位在葉綠體上的蛋白質(zhì)NUS1，NUS1參與葉綠體RNA的代謝調(diào)控過程，蛋白特異地在幼嫩葉片中積累，低溫處理能增強其積累［39］。v2編碼一個定位在質(zhì)體和線粒體上的鳥苷酸激酶GK，GK是鳥嘌呤代謝通路中的關(guān)鍵酶，催化GMP磷酸化形成GDP，該基因的突變抑制了早期質(zhì)體轉(zhuǎn)錄本的翻譯，破壞了葉綠體的蛋白翻譯機制［40，41］。v3編碼核糖核酸還原酶RNR 的大亞基RNRL1，突變體的RNR活性降低，葉綠體DNA拷貝數(shù)與細(xì)胞核的DNA拷貝數(shù)比值降低，參與葉綠體轉(zhuǎn)錄翻譯以及光合作用的基因的表達(dá)量都發(fā)生了改變［42］。Yue等［43］發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)加工肽酶（SPP）是一種金屬內(nèi)肽酶，加工自胞質(zhì)合成后運輸?shù)饺~綠體的前體蛋白，該基因突變引起白化，在突變體的幼苗中，Rubisco 小亞基未被準(zhǔn)確加工，與葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)下降，同時spp過表達(dá)植株中捕光葉綠素a/b蛋白復(fù)合體相關(guān)基因Cab1R和Cab2R表達(dá)明顯增強，這些結(jié)果表明SPP在水稻生長早期葉綠體的生物合成過程中起著重要的作用。Miyoshi等［44］證明OsHAP3A、OsHAP3B和OsHAP3C都編碼與CAAAT-box 結(jié)合的復(fù)合體，HAP3亞基控制定位于葉綠體上核蛋白基因的表達(dá)，在反義表達(dá)OsHAP3A的轉(zhuǎn)基因植株中，OsHAP3A、OsHAP3B和OsHAP3C的表達(dá)量都下降，葉綠體片層發(fā)育不完全，無淀粉粒積累，最終降解。

4.3 類胡蘿卜素代謝途徑基因突變引起的葉色突變

類胡蘿卜素是植物光合作用中重要的一類光合色素。目前已知的類胡蘿卜素超過600種，分為含氧原子的葉黃素類和不含氧原子只含碳?xì)涞暮}卜素類。類胡蘿卜素既可以吸收光能用于光合作用，又可以保護(hù)葉綠素不受光氧化損害。

葉黃素是植物中最豐富的類胡蘿卜素，對光系統(tǒng)的組裝和穩(wěn)定起著重要作用。Lü等［45］發(fā)現(xiàn)水稻Cyt P450基因編碼一個定位在葉綠體上的類胡蘿卜素β-環(huán)羥化酶CYP97A4，參與葉黃素的合成。CYP97A4 在葉片的表達(dá)水平高于穗、葉鞘、莖稈和根部。與野生型相比，突變體中葉黃素的含量降低了12%-24%，而α-胡蘿卜素含量顯著增加，但是葉綠素a/b的水平并沒發(fā)生變化；另外，在高光強處理突變體時，突變體中積累了更多的活性氧。作者推測葉色白化可能是植物葉片葉黃素含量降低后，光系統(tǒng)性能不穩(wěn)定，光合能力下降造成的。

“斑馬”突變體是一類葉片綠色-白化交替出現(xiàn)的突變體，在作物中廣泛存在，突變體光合速率下降，葉綠素含量降低。Chai等［46］克隆了水稻的斑馬葉基因ZEBRA2，ZEBRA2主要在成熟葉的葉肉細(xì)胞中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)該基因編碼一個類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO），是催化順式-番茄紅素向反式-番茄紅素轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵酶。Han等［47］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，zebra2突變體中大量積累了單線態(tài)氧和順式番茄紅素；其中單線態(tài)氧是氧分子吸收能量，使一個外層電子從基態(tài)進(jìn)行電子自旋反轉(zhuǎn)，形成的不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)電子；番茄紅素是一種廣泛存在的類胡蘿卜素，在由順式向反式轉(zhuǎn)換的過程中能猝滅單線態(tài)氧；突變體的清除活性氧的功能受到阻礙，導(dǎo)致了白綠相間的表型。

4.4 核質(zhì)互作紊亂造成的白化

質(zhì)體基因組與核基因組之間信號傳導(dǎo)是雙向的，一方面質(zhì)體的發(fā)育受核基因控制，如參與葉綠體生物合成過程中加工和運輸?shù)牡鞍?、類囊體復(fù)合物和光合作用元件的形成、葉綠素的積累和光感受器信號傳導(dǎo)的蛋白大都是由核基因編碼的；另一方面，發(fā)育停滯或者損傷的質(zhì)體可以通過反饋信號途徑調(diào)控核基因的表達(dá)。水稻v2突變體在一定的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出白化表型，突變體中參與質(zhì)體轉(zhuǎn)錄/翻譯活動的蛋白OsRpoTp和OsSIG2A高水平表達(dá)，但是參與光合作用的蛋白表達(dá)受到抑制；多核糖體分析表明，質(zhì)體基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯在葉綠體分化早期已經(jīng)被阻斷，核質(zhì)遺傳信息不能有效地交流，造成葉片白化；多核糖體分析是通過從細(xì)胞中分離出核糖體的方法來確定哪些基因生成了蛋白質(zhì)的方法［41］。

5 水稻白化突變體的應(yīng)用前景

5.1 水稻白化突變體在育種實踐中的應(yīng)用

在育種實踐中，水稻葉色白化是理想的可以用于育種的標(biāo)記性狀。舒慶堯［48］認(rèn)為應(yīng)用于雜交水稻生產(chǎn)的標(biāo)記性狀應(yīng)需滿足以下條件：標(biāo)記性狀明顯，在苗期即可鑒別；標(biāo)記性狀為隱性核基因控制；標(biāo)記性狀穩(wěn)定表達(dá)不易受環(huán)境因素影響；標(biāo)記性狀表達(dá)對不育系及其雜種后代的農(nóng)藝性狀無負(fù)效應(yīng)。利用隱性核基因控制的葉色突變體，通過雜交、回交等手段將葉色突變性狀導(dǎo)入三系或兩系的不育系，在苗期就可準(zhǔn)確無誤地識別假種并予以剔除，確保良種的純度及質(zhì)量；提高單位面積產(chǎn)量。葉榮國［49］把白化轉(zhuǎn)綠突變體作輪回親本與不育系龍?zhí)馗雜交并且回交，獲得BC1群體，初步篩選出4個較為理想的葉色標(biāo)記的不育系。舒慶堯利用葉色突變體與Ⅱ-32A雜交和連續(xù)回交轉(zhuǎn)育成了苗期攜帶白化葉色標(biāo)記的不育系白豐A。浙江大學(xué)核農(nóng)所［47］用核輻射技術(shù)也培育出帶有葉色標(biāo)記雜交水稻不育系全龍A。

另外，水稻白化轉(zhuǎn)錄突變體也是品種遺傳改良的特異材料。通常情況下，葉綠素含量下降會對作物品質(zhì)產(chǎn)生不好的影響，但是目前對茶葉、煙草等經(jīng)濟作物的研究表明，葉綠素的缺失也會使其具有特殊的優(yōu)良品質(zhì)。雖然在水稻方面的報道比較少，但是有證據(jù)表明利用葉色突變體可以增加水稻的遺傳多樣性，從而滿足食用和加工用糧對品質(zhì)的多樣化需求。ⅡA2是由ⅡB2突變系與親本Ⅱ32A連續(xù)回交育成的帶葉色標(biāo)記的不育系，陳善福等［50］通過對其稻米理化品質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，表觀直鏈淀粉含量從23.7%下降到19.7%，堿消值從3.5上升到6.7，崩解值從46.8 RVU上升到70.9 RVU，稻米品質(zhì)得到改進(jìn)。因此在遺傳改良過程中，根據(jù)作物的經(jīng)濟性狀靈活選用葉色突變體也是值得關(guān)注的。

5.2 水稻白化突變體在基礎(chǔ)研究中的前景

水稻基因組測序的完成和現(xiàn)代分子生物學(xué)的飛速發(fā)展為水稻白化突變體的研究提供了廣闊的前景。首先，水稻白化突變體是研究植物葉綠素代謝調(diào)控和葉綠體發(fā)育機理的理想材料。通過傳統(tǒng)的圖位克隆等方法，發(fā)掘和鑒定葉綠素代謝和葉綠體分化的關(guān)鍵基因，再運用現(xiàn)代分子生物學(xué)的手段進(jìn)行調(diào)控機理和代謝通路的研究，能夠快速的提升研究效率，為我們更加全面和深刻的理解光合機理，也為提高作物的光合產(chǎn)量奠定理論基礎(chǔ)。其次，越來越多的證據(jù)顯示，造成水稻白化的基因并不存在于葉色相關(guān)的途徑之中，這也為基礎(chǔ)研究開辟了新的方向，相信隨著科技的不斷進(jìn)步，我們一定會更加充分的利用水稻白化突變體，豐富和完善我們的認(rèn)識。

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