聞?wù)嬲?，劉運權(quán)，林首恒，林 茵，劉 偉

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642)

金釵石斛(Dendrobium nobile)具有很高的觀賞價值，是春石斛育種中最常用的親本之一［1］．春石斛花芽的形成需要一定時間的低溫即春化作用的誘導(dǎo)，不完善的催花技術(shù)導(dǎo)致目前年花市場國產(chǎn)金釵石斛等春石斛質(zhì)量低下，競爭力遠低于進口產(chǎn)品．生產(chǎn)中普遍采用冷庫或高山基地進行低溫處理調(diào)控花期，能耗和運輸?shù)瘸杀靖撸湓诖菏倪\用中效果也不穩(wěn)定．研究表明，植物生長物質(zhì)在植物花芽分化過程中發(fā)揮重要作用［2］，細胞分裂素(cytokinin，CTK)在促進石斛等蘭花的花芽分化中效果明顯［3］，利用 450 mg/L 6-BA 處理盆栽春石斛(red emperor“prince”orchid)，不經(jīng)低溫處理可誘導(dǎo)其開花［4］．但是利用CTK調(diào)控開花的技術(shù)還未在生產(chǎn)中推廣，處理過程復(fù)雜、效果不穩(wěn)定是主要原因．對花芽分化過程中CTK作用機理的研究，有助于該技術(shù)的完善和推廣應(yīng)用．

外源CTK誘導(dǎo)石斛成花的過程中，內(nèi)源CTK含量增加［5］，油菜經(jīng)低溫誘導(dǎo)后，內(nèi)源iP類CTK含量增加［6］，說明CTK通過影響內(nèi)源CTK的含量影響花芽的分化，后者則參與了春化作用途徑中的成花轉(zhuǎn)換過程．DAVIS［7］提出在CTK合成部位根尖中，F(xiàn)LC和自主途徑基因大量表達，其中CTK與這些基因之間可能具有一定的相互作用．FLC是擬南芥春化作用途徑的關(guān)鍵基因，而在單子葉植物中，至今未克隆到相關(guān)同源基因，VRN1途徑是目前單子葉植物中唯一已經(jīng)確定的春化作用途徑．VRN1是擬南芥中AP1/FUL的同源基因，其表達受春化作用上調(diào)［8］．最近，利用高通量測序技術(shù)分別從金釵石斛［9］和墨蘭［10］轉(zhuǎn)錄組中分離到了 VRN1途徑的同源基因，說明蘭科植物春化作用途徑與禾本科等單子葉植物類似．

本研究利用CTK類物質(zhì)噻重氮苯基脲(thidiazuron，TDZ)在常溫下處理金釵石斛成株，觀察其對開花的影響．并通過同源克隆分離金釵石斛VRN1-like基因，利用半定量RT-PCR研究CTK處理對其表達的影響，以初步揭示CTK對金釵石斛開花的影響及其分子機理，為完善春石斛花期的化學(xué)調(diào)控技術(shù)提供基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 材料

金釵石斛成株和類原球莖由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物化控實驗室提供．金釵石斛成株栽培于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物種質(zhì)繁育中心溫室，選取生長狀態(tài)一致、止葉完全展開的植株，于11月用20 mg/L TDZ噴灑葉片，清水處理為對照，置于日溫20～26℃，夜溫18～20℃下培養(yǎng);另選取部分植株，置于日溫20～26℃，夜溫4℃下培養(yǎng)，所有材料每周淋水1次．處理后0、5、10、15、20、25、30 d 切取腋芽，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?30 d后所有材料移至溫室培養(yǎng)，日溫20～26℃，夜溫12～18℃(12月的自然溫度，加風(fēng)機水簾調(diào)控)，觀察其開花情況;類原球莖在無激素培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)30 d后，分別轉(zhuǎn)入含有1．6 mg/L 6-BA和1．6 mg/L TDZ的培養(yǎng)基中培養(yǎng);另取部分材料繼續(xù)轉(zhuǎn)接至無激素培養(yǎng)基，在4℃條件下繼代培養(yǎng)，于轉(zhuǎn)接 0、5、10、15、20 d 后取材，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

1．2 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

用Trizol(Tiangen)法提取總RNA．以總RNA為模板，通過MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈．

1．3 金釵石斛DnVRN1基因保守區(qū)的合成

VRN1為AP1/FUL類MADS盒轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)GenBank中登錄的蘭科植物AP1/FUL類基因的序列和小麥等不同植物中的VRN1序列，設(shè)計特異性上游引物VF1(5'-TCTCCGTGCTCTGTGATGCT-3')和下游引物VR1(5'-GTGCCTGAGGTGATTCTTCTTC-3')，以1．2中得到cDNA為模板，通過PCR克隆DnVRN1保守區(qū)片段，得到的產(chǎn)物連接T載體后測序驗證．

1．4 DnVRN1全長cDNA序列的擴增

根據(jù)獲得的DnVRN1的保守區(qū)序列設(shè)計引物，利用3'-和5'-RACE，分離DnVRN1基因的cDNA全長并測序．用于3'-RACE的cDNA第一鏈的轉(zhuǎn)錄用接頭引物AP1(5'-GACTCGAGTCGACATCGA(T)17-3')代替oligo(dT)18，PCR引物為基因特異性引物VF2(5'-GCCAAAGCATTGACGCA-3')和接頭引物AP3(5'-GACTCGAGTCGACATCG-3')．采用TaKaRa 5'-Full RACE Kit進行DnVRN1 5'端未知序列的擴增，所用的基因特異性引物為VR2(5'-GGTTCTTCTTCATTGGCTCTTG-3')、VR3(5'-GGAGTTGGGACAGAATCGGAAATC-3')．為驗證所得的序列，另用引物VTF(5'-CCACCCTCCACTCCATTCTT-3')/VR3(5'-GGAGTTGGGACAGAATCGGAAATC-3')擴增全長cDNA．

1．5 序列分析

利用DNAstar軟件對DnVRN1全長cDNA進行拼接，通過 ORF Finder預(yù)測開放閱讀框，并通過BlastX搜索同源蛋白．利用ClustalW對序列進行比對分析．

1．6 半定量RT-PCR分析DnVRN1的表達

根據(jù)DnVRN1全長序列設(shè)計引物QF(5'-AACCCCCAGGCTGATTG-3')和QR(5'-GGCTCTTGCTTGAAACG-3')，以Actin基因為內(nèi)參(引物為AF(5'-TGCTTCTAAAGTTTGCTAT-3')和 AR(5'-ACTCAATCCAGACTACAA-3'))，進行半定量 RT-PCR．即在相同的擴增條件和相同的體系組成的條件下，分別對目的產(chǎn)物和參照基因進行PCR擴增，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過比較產(chǎn)物的量初步研究目的基因的表達情況．為獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果，設(shè)置了技術(shù)性重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)，即每個PCR反應(yīng)進行3次重復(fù)，每個處理也使用3個不同批次提取的總RNA樣品．

2 結(jié)果與分析

2．1 TDZ對金釵石斛開花的影響

利用20 mg/L的TDZ噴施葉面30 d后，金釵石斛普遍形成花芽，誘導(dǎo)率100%，并于處理后90 d左右全部開花;低溫處理30 d后，材料也普遍形成花芽，但開花時間較TDZ處理材料晚20 d左右;對照材料則無花芽形成(圖1A)．以上結(jié)果表明，噴施TDZ能代替低溫處理誘導(dǎo)金釵石斛開花．

2．2 金釵石斛VRN1-like基因全長cDNA序列的克隆

以金釵石斛類原球莖總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用引物 VF1/VR1通過 PCR擴增得到了530 bp的保守區(qū)片段(圖2)，Blast同源搜索表明該片段與球花石斛(Dendrobium thrysiflorum)中的FUL-like MADS-box基因(AY927236)具有高的同源性．根據(jù)這一片段設(shè)計基因特異引物，并通過RACE擴增基因的全長序列．3'-RACE擴增獲得686 bp的末端片段(圖2(2))，經(jīng)測序，所得序列與MADS-BOX部分序列有重疊．兩序列拼接獲得包括了3'末端的cDNA片段．根據(jù)這一序列設(shè)計5'-RACE的基因特異引物，通過擴增獲得1條648 bp的5'末端片段(圖2(3))．經(jīng)克隆測序表明，該片段可與3'-RACE產(chǎn)物拼接得到902 bp的全長cDNA序列．為驗證上述結(jié)果，根據(jù)拼接后的序列重新設(shè)計引物，通過RT-PCR擴增得到了750 bp左右的完整ORF片段(圖2(4))．BlastX搜索表明該序列編碼的蛋白序列與小麥中VRN1蛋白同源，將其命名為 DnVRNA，GenBank，登錄號為 EF535598．

圖1 TDZ對金釵石斛開花(A)和腋芽中DnVRNA表達(B)的影響Figure 1 Effect of TDZ on flowering(A)and expression of DnVRNA in axillary buds(B)of Dendrobium nobile

圖2 金釵石斛DnVRNA全長cDNA序列Figure 2 Isolation of full-length DnVRNA cDNA from Dendrobium nobile

2．3 DnVRNA 序列分析

本研究中獲得的DnVRNA全長cDNA為902 bp(包括poly(A)序列)，包括部分5'UTR區(qū)、完整的ORF和3'UTR區(qū)(圖3)．

圖3 DnVRNA序列分析Figure 3 Sequence analysis of DnVRNA

得到的DnVRNA的ORF長741 bp，編碼1條含247個氨基酸殘基的多肽鏈，含1個MADS-BOX域和1個K-BOX域，為典型的MADS-BOX蛋白．5'UTR區(qū)長24 bp，可能并不完整，需要進一步試驗確定．3'UTR區(qū)包括poly(A)尾在內(nèi)長136 bp．蛋白比對分析表明，DnVRN1蛋白與禾本科植物小麥等的VRN1蛋白同源，其中與高羊茅(Festuca arundinacea)VRN1的氨基酸序列一致性為63%，與小麥(Triticum monococcum)VRN1蛋白的氨基酸序列一致性為62%，而與球花石斛中的 DthyrFL1具有95%的序列相似性．蛋白的C端具有6個氨基酸組成的單子葉植物FUL-like基因保守基序LPPWML/V(圖4)．

圖4 金釵石斛DnVRN1與其他物種VRN1蛋白序列比對分析Figure 4 Alignments of VRN1 protein from Dendrobium nobile and other organisms

2．4 CTK和低溫處理對金釵石斛類原球莖中DnVRNA表達的影響

以DnActin基因為內(nèi)參，通過半定量RT-PCR檢測DnVRNA基因的表達變化，結(jié)果表明，TDZ處理可以促進金釵石斛腋芽中DnVRNA的表達(圖1B)．為進一步分析CTK對DnVRNA表達的影響，以金釵石斛類原球莖為材料，分別用1．6 mg/L的6-BA和TDZ處理后，檢測其中DnVRNA的表達情況．半定量RT-PCR結(jié)果顯示6-BA和TDZ都能顯著促進DnVRNA表達．另外，低溫處理(4℃)也能促進類原球莖中DnVRNA的表達(圖5)．類原球莖是含有胚性細胞團的分生能力活躍的分生組織，其中基因的表達情況能在一定程度上反映出其在腋芽中的表達情況，本研究中TDZ處理后，在腋芽和類原球莖中DnVRNA表達量都增加．

圖5 CTK和低溫處理后金釵石斛類原球莖中DnVRNA表達Figure 5 Expression analysis of DnVRNA in PLBs of Dendrobium nobile after treated by CTK and cold

3 討論

用CTK類化學(xué)物質(zhì)調(diào)控春石斛開花，能有效地降低生產(chǎn)成本．春石斛催花中使用最多的是6-BA，但都是在相對低溫(18～20℃)的條件下使花期提前［3］．SAKAI等［4］的研究表明，6-BA 可以在不經(jīng)低溫處理的情況下誘導(dǎo)春石斛開花．在春石斛離體培養(yǎng)過程中，TDZ是除6-BA之外使用最多的開花誘導(dǎo)物，能顯著促進鐵皮石斛等在內(nèi)的春石斛開花［11］．本研究利用TDZ在常溫下成功誘導(dǎo)了金釵石斛成株開花，花芽誘導(dǎo)率達到了100%，與低溫誘導(dǎo)相比，花期提前了20 d左右，且花朵形態(tài)色澤無變化，與6-BA對春石斛的作用一致，TDZ可以替代低溫誘導(dǎo)金釵石斛成花．對其分子機理的深入研究，將有利于該技術(shù)的完善和實際應(yīng)用．

目前對金釵石斛成花的分子機理缺乏了解，相關(guān)研究的進行有待更多花發(fā)育相關(guān)基因的克隆及其功能研究等基礎(chǔ)工作的積累．LIANG等［9］通過cDNA文庫測序，分離了1個VRN1-like基因DnVRN1，該基因編碼的蛋白與小麥VRN1蛋白(AAZ76882．1)的序列相似性為61%，其表達受春化作用的上調(diào)．說明春化作用誘導(dǎo)金釵石斛成花的分子機理可能與單子葉植物中已經(jīng)確定的VRN1途徑類似．本研究通過同源克隆獲得了另一個VRN1-like基因DnVRNA，其編碼的蛋白序列與小麥VRN1蛋白和DnVRN1的序列相似性分別為62%和61%，說明DnVRNA和DnVRN1為金釵石斛中的VRN1-like同源基因．另外，同源比對分析表明，DnVRNA是球花石斛中DthyrFL1的同源基因，在花發(fā)育過程中，DthyrFL1的表達量隨花芽的分化而增加［12］，這與DnVRNA在類原球莖中的表達受低溫誘導(dǎo)的結(jié)果一致，說明該基因可能參與春化作用途徑．

本研究發(fā)現(xiàn)的DnVRNA參與春化作用途徑，而CTK可以誘導(dǎo)DnVRNA在腋芽和類原球莖中的表達，表明該基因在CTK替代低溫誘導(dǎo)金釵石斛成花的過程中具有一定的作用．對于細胞分裂素和花發(fā)育相關(guān)的MADS-box基因之間的關(guān)系，早期就有相關(guān)報道．ESTRUCH等發(fā)現(xiàn)細胞分裂素可以改變花器官的發(fā)育，并抑制3種 MADS-box基因:DEFA，GLO，PLENA 的表達［13］．在風(fēng)信子(Hyacinthus orientalis L．)的再生花芽中，細胞分裂素可以調(diào)節(jié)AG類MADS-box基因HAG1的活性，進一步誘導(dǎo)花芽的發(fā)生并決定花器官的類型［14］．而使用低濃度的細胞分裂素處理白芥菜(Sinapis alba)植株的頂端，可以代替長日條件激活SOC1同源基因SaMADS A的表達，進而引起花轉(zhuǎn)換的發(fā)生［15］．在短日條件下，CTK通過調(diào)控FT同源基因TSF及其下游基因SOC1 表達促進擬南芥開花［16］．DAVIS［7］提出 CTK與自主途徑基因以及春化作用途徑關(guān)鍵基因FLC之間可能具有一定的相互作用．上述研究中，SOC1是春化作用、自主途徑、GA途徑誘導(dǎo)開花過程中的整合基因，其表達量的增加可以直接促進下游目標(biāo)基因的表達，誘導(dǎo)植物開花［17］．而FLC是擬南芥春化作用途徑中的關(guān)鍵基因［8］，本研究發(fā)現(xiàn)DnVRN1可能參與春化作用的調(diào)控，CTK對其表達的影響，或許可以部分解釋CTK代替春化作用誘導(dǎo)金釵石斛開花的原因，但是其具體分子機理的闡釋還需要進一步的研究．

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