黎 敏 李翠文 侯培珍

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科,內(nèi)蒙古包頭014010

腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的耐受是多藥耐藥(MDR)的重要機(jī)制之一,Bax、BCL-2是調(diào)控凋亡的關(guān)鍵基因,是通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[1].筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)班貞1號(hào)、TMP聯(lián)合5-FU對(duì)人胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞有較強(qiáng)逆轉(zhuǎn)作用[2]該研究試圖從細(xì)胞凋亡的角度探討其逆轉(zhuǎn)人胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞耐藥的機(jī)制,為胃癌MDR的治療提供新方法.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化研究所惠贈(zèng)的人胃癌耐阿霉素細(xì)胞株SGC-7901/ADR細(xì)胞.

1.2 藥物、試劑與儀器

①藥物與試劑:斑貞1號(hào):斑蝥、女貞子、露蜂房、山茱萸按一定比例制備(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院),原生藥含量:0.2 g/mL,4℃保存.TMP(浙江新華制藥有限公司)、RPMI1640(美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品)、5-FU(南通精華制藥有限公司產(chǎn)品)、新生小牛血清(賽默飛世爾生物化學(xué)制造(北京)有限公司),四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品).②儀器:PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)AB公司),RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞處理于實(shí)驗(yàn)兩周前培養(yǎng)于不含ADM的培養(yǎng)液中取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901/ADR細(xì)胞,以5X104/mL接種于6孔板上,2 mL/孔,培養(yǎng)24h后,分別在實(shí)驗(yàn)孔加入等量如下試劑:A:新培養(yǎng)液(對(duì)照組),B:5-FU稀釋液(5-FU組);C:班貞1號(hào)稀釋液(班貞1號(hào)組);D:班貞1號(hào)+5-FU稀釋液(班貞1號(hào)+5-FU);E:班貞1號(hào)+5-FU+TMP稀釋液(班貞1號(hào)+5-FU+TMP);各組藥物濃度依之前MTT試驗(yàn)的結(jié)果,選取對(duì)應(yīng)的IC50值).繼續(xù)培養(yǎng)48h后,用PBS緩沖液沖洗1次,準(zhǔn)備提取總mRNA.

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)(PCR方法按照文獻(xiàn)提取組織RNA,)采用Trizol試劑盒提取RNA,引物均由大連寶生物工程有限公司合成,用于特異性擴(kuò)增的Bcl-2基因序列的正義列引物為5-TCTCTCCC

GACATGACCGAGG-3',反義列引物為5-CCAGGAATATGCCCCGACTTC-3,Bax基因序列的正義列引物為5'-ACCACCCTGGTCTTGGATCC-3',反義列引物為5'-GCGTCCACCAAGAAGCTGAG-3,-action的正義列為5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3',反義列為5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3',先逆轉(zhuǎn)錄出cDNA,每個(gè)樣品反應(yīng)體系25 uL,即ddH2O13.5 uL,10XPCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 ul,dNTP Mixture 2 uL,Takara Taq 1 uL,目的基因上、下游引物各0.5 uL,各樣品cDNA5 uL,滅菌蒸餾水13.5 uL.Bcl-2擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃、2 min;變性94℃、30 s,退火45℃、30 s,延伸72℃、1 min,35個(gè)循環(huán);最后72℃、延伸8min.Bax擴(kuò)增條件:50℃、2min;95℃、10min;95℃、15 s,60℃、1 min,40個(gè)循環(huán),最后72℃、延伸8 min.擴(kuò)增結(jié)束后,取樣品10 uL,100 V恒壓,2%瓊脂糖電泳60 min.紫外反射透射分析儀采集電泳圖像,凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描得到各電泳帶平均光密度值,目的條帶與內(nèi)參條帶光密度比值為相對(duì)光密度值(relative optical density,ROD).

1.3.3 統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)不同藥物處理后SGC-7901/ADR細(xì)胞的Bcl-2、Baxm-RNA表達(dá)變化

RT-PCR檢測(cè)Bcl-2、BaxmRNA表達(dá)的變化(圖1、2)、凝膠成像分析結(jié)果(表1)顯示,5-FU組與陰性對(duì)照組相比,Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax比值無明顯差異(P>0.05).中西藥聯(lián)合組BaxmRNA表達(dá)明顯增高,Bcl-2mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax比值明顯降低,與陰性對(duì)照組及其他實(shí)驗(yàn)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

3 討論

研究表明,產(chǎn)生耐藥的原因之一是腫瘤細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)失調(diào).有核細(xì)胞在凋亡刺激信號(hào)作用下通過啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)死亡機(jī)制,經(jīng)過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,最終發(fā)生細(xì)胞程序性變性和死亡的過程謂之細(xì)胞凋亡(apoptosis).Bcl-2基因家族在控制細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用,Bax是Bcl-2基因家族中能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白,Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的蛋白.Bax過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞死亡,而Bcl-2過表達(dá)可阻斷或阻礙化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制Bax引起細(xì)胞凋亡的功能,使癌細(xì)胞對(duì)化療藥產(chǎn)生耐藥[3-4].因此Bcl-2/Bax的比值決定了細(xì)胞受凋亡因素刺激后的生與死[5-6].我們前期研究發(fā)現(xiàn)SGC-7901/ADR細(xì)胞對(duì)5-FU具有耐藥性,相對(duì)耐藥性為97.49[7],該研究結(jié)果表明5-FU組Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)量及Bcl-2/Bax的比值與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明Bcl-2、bax蛋白參與耐藥細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥性,推測(cè)Bcl-2、Bax基因參與SGC-7901/ADR細(xì)胞的多藥耐藥.

斑貞1號(hào)合劑以女貞子、山茱萸為輔佐藥,以斑蝥、露蜂房為主藥,各成分按成人(60 kg)的臨床用量制備.其中斑蝥素可抑制腫瘤細(xì)胞DNA和RNA合成,具有以毒攻毒、解毒殺瘤、直接殺傷腫瘤且無骨髓抑制作用[8].女貞子能調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性T細(xì)胞,保護(hù)致突劑誘發(fā)的突變效應(yīng)和染色體損傷[9].作為一種中藥鈣離子通道阻滯劑,TMP可通過多種途徑治療腫瘤,逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用[10].該課題組研究證明:"斑貞1號(hào)對(duì)SGC-7901/ADR細(xì)胞存在逆轉(zhuǎn)作用[11];300 mg/L的TMP能有效提高SGC-7901/ADR細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性,使其相對(duì)耐藥性降至12.89,逆轉(zhuǎn)指數(shù)為8.43倍."[7]且中西聯(lián)合用藥對(duì)SGC-7901/ADR細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用更為顯著[12].該研究結(jié)果顯示,SGC-7901/ADR細(xì)胞經(jīng)中西藥聯(lián)合組處理后,baxmRNA表達(dá)量與斑貞1號(hào)、斑貞1號(hào)+5-FU組比較明顯增高,而Bcl-2mRNA表達(dá)量及Bcl-2/bax比值明顯降低(P<0.05),提示中西藥聯(lián)合可提高Bax的表達(dá),抑制Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)了SGC-7901/ADR細(xì)胞凋亡.這種凋亡可能是受到抑制凋亡基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)和促進(jìn)凋亡基因Bax表達(dá)上調(diào)的調(diào)節(jié),進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)耐藥細(xì)胞的顯著逆轉(zhuǎn)作用.關(guān)于體外試驗(yàn)結(jié)果能否在體內(nèi)發(fā)揮相同的作用,則有待進(jìn)一步研究證明.

表1 SGC-7901/ADR細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后Bcl-2、Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax mRNA

圖1 SGC-7901/ADM細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后Bax mRNA表達(dá)

圖2 SGC-7901/ADM細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后Bcl-2 mRNA表達(dá)

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