陳鳳娟 朱永澤 朱銳倫 劉國旗 馬 騫 李 潔 彭萬通 陳國舉 曾正志

(1 蘭州大學化學化工學院，蘭州730000)

(2 蘭州金川新材料科技股份有限公司，蘭州 730101)

0 前 言

汞(Hg)是一種劇毒、有腐蝕性并且對環(huán)境有害的元素。一些汞鹽(如，HgCl2)能夠充分揮發(fā)并以氣體形式存在[1]。汞(Hg)可以通過空氣、水、食品、疫苗、化妝品等多種途徑傳遞，并且能夠在環(huán)境中持續(xù)存在、在食物鏈中累積，對于環(huán)境以及生物體都產生了嚴重的危害，這引起了人們強烈的關注[2]。

科研工作者對具有活潑性質的分子自組裝受體做了深入的研究，發(fā)現(xiàn)其具有多種潛在的應用價值，例如分子及藥物的傳遞[3]，分子催化[4]等。三足配體由于具有特殊的半剛性結構，在與金屬配位時能夠表現(xiàn)出特有的選擇性配位能力，近些年來已成為熱門的離子選擇性受體。

氯化汞(HgCl2)在溶液中以分子形式存在時，很容易與氮(N)、氧(O)等配位原子發(fā)生配位[5]。我們設計合成了一些含有N、O 等配位原子的三足配體，作為汞離子的選擇性受體。氯化汞(HgCl2)能夠很容易的與其發(fā)生反應生成汞(Ⅱ)的配合物，這些汞(Ⅱ)的配合物非常穩(wěn)定，能夠很好的遏制氯化汞等進入到生物循環(huán)系統(tǒng)之中。此外，本研究利用紫外-可見光譜滴定、穩(wěn)態(tài)熒光光譜滴定、圓二色譜和粘度實驗研究了三足配體汞配合物與小牛胸腺DNA 的相互作用。

1 實 驗

1.1 測試儀器及試劑

化合物熔點用北京XT4-100x 顯微熔點儀測定；C，H，N 分 析 采 用Elemental Vario-EL 型 元 素 分 析儀； 紅外光譜(4 000～400 cm-1) 用Therrno Mattson FTIR 光譜儀(KBr 壓片法)測定；1HNMR 和13CNMR光譜測試用Varian200 核磁共振儀測定(CDC13為溶劑，Me4Si 為 內 標)； 質 譜 測 試 用 HP-5988A spectrometer (EI at 70 eV)；晶體測試用Bruke Smart APEX ⅡCCD 面探測儀；粘度用烏氏粘度計在恒溫槽中測定。

Tris-HCl 緩沖溶液：該緩沖溶液為水溶液，其中三羥甲基氨基甲烷(tris)的濃度為10 mmol·L-1，NaCl的濃度為50 mmol·L-1，加鹽酸調節(jié)pH 到7.2。小牛胸腺DNA(CT-DNA)購自Sigma 公司，用Tris-HCl 緩沖溶液配置的樣品保存在冰箱，一周內用完。該實驗所用到的所有試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。三(2-氯乙基)胺鹽酸鹽根據(jù)文獻[6]合成。

1.2 配體的合成

取3.0 mmol 水楊醛于100 mL 的圓底燒瓶中，加入50 mL 的無水乙醇及4.0 mmol 的NaOH 固體，常溫攪拌0.5 h。然后加入1.0 mmol 的三(2-氯乙基)胺鹽酸鹽，加熱使其回流6 h，冷卻到室溫，然后傾入到150 mL 的冰水中，出現(xiàn)大量沉淀，過濾，并用水及冷的無水乙醇洗滌，干燥后得白色固體粉末即為配體L，二氯甲烷中重結晶可得無色塊狀晶體。產率： 67%。1H NMR (CDCl3) δ(ppm)： 3.25 (t, 6, J=7 Hz, CH2N), 4.20 (t, 6, J=7 Hz, CH2O). MS： m/z=462.2[M+H]+。

1.3 配合物的合成

稱取配體L 0.092 2 g (0.2 mmol)于25 mL 的圓底燒瓶中，加入10 mL 的甲醇，加熱使其溶解，待其溶解后，慢慢滴加5 mL (0.2 mmol)的HgCl2甲醇溶液到圓底燒瓶中，繼續(xù)反應3.0 h 后，冷卻，過濾，濾液用自然揮發(fā)法培養(yǎng)單晶，1 周后得無色塊狀晶體。產 率：～72%。元 素 分 析 (C33H45Cl2HgNO9) (%)： C,45.62; H, 5.15; N, 1.49。理論值 (%)：C, 45.50; H,5.21; N, 1.61。FTIR (KBr pellet) (cm-1)： 3 445 (br),2 935 (s), 2829 (m), 2 360 (m), 1 601 (s), 1 491 (s),1 453 (s), 1 368 (s), 1 285 (m), 1 234 (vs), 1 090 (vs),1 049(vs), 978 (s), 909 (s), 757 (s), 676 (w), 609 (w),509 (w)。

Scheme 1 Synthetic routeine of ligand L

1.4 測試方法

1.4.1 紫外吸收光譜

向樣品池及參比池中分別加入2.0 mL 的Tris-HCl 緩沖溶液，掃描基線，再向樣品池中加入20 μL的1.0×10-3mol·L-1的配合物溶液，掃描其紫外吸收光譜； 然后向樣品池及參比池中分別加入相同體積的CT-DNA 儲備液，測定配合物的紫外吸收光譜隨CT-DNA 加入量的變化。配合物與CT-DNA 的結合常數(shù)可通過公式1 計算[8]：

其中，cDNA表示樣品池中CT-DNA 的濃度，εa，εb，εf分別表示吸光系數(shù)(Aobsd/cM),未與DNA 結合的配合物和已與DNA 結合的配合物的吸光系數(shù)。結合常數(shù)Kb就是以cDNA/(εa-εf)對cDNA作圖所得的斜率與截距的比值。

1.4.2 熒光光譜

向熒光比色皿中加入2.0 mL 的Tris-HCl 緩沖溶液，再加入20 μL 的1.0×10-3mol·L-1的配合物溶液，混合均勻后掃描其熒光發(fā)射光譜；然后再逐漸加入CT-DNA 儲備液，測定配合物的熒光發(fā)射光譜隨CT-DNA 的加入量的變化。配合物與CT-DNA 的結合常數(shù)可通過公式2 計算[9]：

其中，ct表示配合物的總濃度，F(xiàn) 表示加入DNA后的熒光強度，F(xiàn)0、Fmax分別表示配合物在未加入DNA 時的熒光強度和與DNA 反應后的最大熒光強度。

1.4.3 粘 度

溶液粘度用烏式粘度計在25(±0.1) ℃的恒溫槽里測量。首先向粘度計中加入10 mL 的Tris-HCl 緩沖溶液，測定溶液流過毛細管所用的時間t0(s)；然后加入100 μL 1.0×10-3mol·L-1的DNA 溶液，使粘度計中DNA 的濃度為1.00×10-5mol·L-1，再記錄此溶液通過毛細管所用的時間tD(s)；之后向溶液中逐漸加入被測化合物溶液(濃度是1.00×10-3mol·L-1)，每次10 μL，同樣測定混合溶液流過毛細管所用的時間t(s)。溶液的粘度值與溶液流過粘度計中的毛細管所花費的時間成正比，因此溶液粘度的比值(η/η0)1/3等于耗費時間的比值[(t-t0)/(tD-t0)]1/3。以(η/η0)1/3對1/Rt 作圖可觀察被測化合物對DNA 溶液粘度的影響(Rt 是DNA 與化合物物質的量濃度的比值：cDNA/c被測化合物)，η0和η 分別是單獨的DNA 溶液和含有不同濃度化合物溶液的粘度[10]。

1.4.4 配體及配合物的晶體結構測試

將合適大小的配體L 的晶體 (0.25 mm×0.32 mm×0.31 mm)及配合物的晶體(0.37 mm×0.34 mm×0.28 mm)置于Rigaku RAXIS-RAPID 面探測儀上，于296 K 下用經(jīng)石墨單色器單色化的Mo Κα(λ=0.071 073 nm) 輻射作為衍射光源進行X 射線單晶結構測試。數(shù)據(jù)用multi-scan 和sadabs 軟件校正后，以可觀測的獨立衍射點(7150)進行結構計算。用SHELXTL-97 軟件包進行結構解析，初結構用直接法解出，非氫原子坐標是在以后的數(shù)輪差值Fourier 合成中陸續(xù)確定的[11]?；贔2對全部非氫原子坐標及其各向異性熱參數(shù)進行全矩陣最小二乘法修正，所有氫原子均為理論加氫。配體L 及配合物的晶體學數(shù)據(jù)及結構精修參數(shù)分別列于表1 中。

CCDC： 952313, L; 843072, complex.

表1 配體及配合物的晶體學數(shù)據(jù)及結構精修參數(shù)Table 1 Crystallographic data for ligand and complex

Continued Table 1

2 結果與討論

2.1 配體L 及配合物的晶體結構分析

X-射線單晶衍射分析表明配體L 是以單斜晶系、C2/c 空間群結晶，其3 條側鏈存在非晶體學的偽C3對稱性(如圖1 所示)。配體L 的主要的鍵長及鍵角列于表2 中。以氮原子(N1)為中心3 個鍵的鍵長和鍵角分別為0.145 1 (2) nm, 0.1459 2 (19) nm,0.145 7(2) nm, 115.47(13)°, 114.41(13)°, 113.57(13)°。這些鍵長和鍵角的大小與先前所報道的其它三足配體相一致[12]。

圖1 配體L 的晶體結構圖Fig.1 Crystal structure of L

表2 配體L 的主要的鍵長及鍵角Table 2 Bond lengths and bond (nm) angles (°) for ligand and complex

Continued Table 2

圖2 配合物的晶體結構圖Fig.2 Crystal structure of complex

2.2 配合物與DNA 的相互作用研究

2.2.1 紫外吸收光譜

配合物與CT-DNA 作用的紫外吸收光譜變化如圖3 所示。配合物在220 nm 附近有很強的吸收峰，這主要歸于配合物中的π→π* 躍遷。隨著所加入DNA 濃度的逐漸增加，配合物的吸收峰強度逐漸降低，并伴隨有較明顯的紅移。吸收峰強度降低了30.3%，向高波數(shù)分別紅移了12 nm。這種特征的紫外吸收光譜的變化說明了配合物與DNA 之間以插入方式發(fā)生相互作用[14]。在這種作用模式下，插入配體的π* 軌道與堿基對的π 軌道發(fā)生耦合，降低π→π* 躍遷的能量；其次，由于耦合的π* 軌道部分填充電子，降低躍遷的可能性； 因此當配合物與DNA 以插入方式結合時會同時出現(xiàn)吸收峰降低及紅移現(xiàn)象[15]。

為了定量的比較配合物與DNA 的結合力，我們利用配合物的最強吸收峰的強度變化計算了它們與DNA 作用的結合常數(shù)。由圖3 可知，配合物與DNA的結合常數(shù)為7.34×105L·mol-1。

2.2.2 熒光光譜分析

配合物與DNA 作用的熒光光譜變化如圖4 所示。在未加入DNA 的情況下，配合物在Tris-HCl 緩沖溶液中表現(xiàn)出較弱的熒光發(fā)射強度。隨著DNA 濃度的不斷增加，配合物的熒光發(fā)射強度也在不斷增大，并且配合物還發(fā)生了較明顯的紅移現(xiàn)象。這是由于當配合物插入DNA 堿基對后，DNA 雙螺旋結構內的疏水環(huán)境以及配合物中平面芳香基團與堿基對形成耦合堆積，降低了水分子與配合物碰撞頻率，從而產生熒光敏化作用[16]；配合物的紅移現(xiàn)象與其紫外吸收光譜相一致。這又進一步說明了配合物與CT-DNA 之間存在著明顯的插入結合相互作用。

圖3 (a) 配合物與CT-DNA 作用的紫外可見吸收光譜變化; (b) 配合物與CT-DNA 作用的cDNA/(εa-εf)對cDNA 的曲線圖Fig.3 (a) Electronic spectra of the complex in the presence of CT-DNA; (b) plots of cDNA/(εa-εf) versus cDNA of the titration of DNA with the complex

圖4 配合物與CT-DNA 作用的熒光光譜變化Fig.4 Fluorescence spectra of the complex reacted with CT-DNA

2.2.3 粘 度

為了進一步證實配合物與CT-DNA 之間的相互作用，我們做了配合物對CT-DNA 粘度影響實驗。由于流體動力學方法對長度的變化非常敏感(如粘度、沉降)，能夠對溶液中的結合方式研究提供最客觀、最重要的測試數(shù)據(jù)[17]。經(jīng)典插入試劑插入到DNA 雙螺旋結構內，相鄰堿基對為容納插入配體而被拉伸，導致DNA 雙螺旋伸長，溶液的粘度增加。如圖5 所示，CT-DNA 的粘度隨著配合物濃度的增加而逐漸變大。粘度實驗清晰的表明，化合物1、2 以插入方式與DNA 相結合，插入到相鄰堿基對的中間，從而導致DNA 雙螺旋鏈的拉伸，提高了DNA 的粘度。粘度實驗進一步驗證了先前從光譜研究中所得出的結論。

圖5 25 ℃下配合物對CT-DNA 粘度的影響Fig.5 Effect of increasing amounts of the complex on the relative viscosity of DNA

3 結 論

綜上所述，本文設計合成了含有N、O 配位原子的三足配體L，該配體與汞離子生成非常穩(wěn)定的配合物，遏制了氯化汞等對生物體及環(huán)境的危害。通過元素分析、紅外光譜、X 射線單晶衍射等測試手段對該配合物的組成和結構進行了表征。此外，我們還對金屬配合物與CT-DNA 的相互作用進行了系統(tǒng)研究，通過紫外吸收光譜、熒光光譜、粘度的測試，結果顯示該配合物與CT-DNA 以插入方式相結合。

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