楊 藝 莘海亮 夏先林 吳文旋* 李勝利

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

維持鈣離子(Ca2+)穩(wěn)恒是動(dòng)物肌肉收縮、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、骨質(zhì)沉積、細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)正常運(yùn)作的基礎(chǔ)［1］。這一魯棒系統(tǒng)受腎重吸收、骨動(dòng)員、胃腸道吸收3個(gè)途徑的精確調(diào)節(jié)［2］。其中，腎重吸收能力有限，骨動(dòng)員需建立在胃腸道Ca2+吸收不足的前提下，二者對(duì)Ca2+的穩(wěn)恒貢獻(xiàn)不大［3］。據(jù)此，調(diào)節(jié)胃腸道Ca2+吸收被認(rèn)為是維持Ca2+穩(wěn)恒的關(guān)鍵因素。

胃腸道采用旁細(xì)胞和跨膜2種方式吸收食糜Ca2+［4－5］。其中，旁細(xì)胞途徑依賴胃腸道內(nèi)外Ca2+電化學(xué)濃度梯度差;而Ca2+的跨膜吸收依賴于胃腸道上皮細(xì)胞運(yùn)載通道蛋白的數(shù)量及活性，可在短期內(nèi)大幅上調(diào)或下調(diào)［6－7］，是機(jī)體調(diào)控胃腸道Ca2+吸收的主要途徑。這一途徑包括3個(gè)步驟:1)Ca2+經(jīng)瞬時(shí)性受體電位通道香草酸受體6(transient receptor potential vanilloid receptor 6，TRPV6)介導(dǎo)入胞;2)與維生素D依賴性鈣結(jié)合蛋白(vitamin－D dependent 9 ku calcium－binding protein，CaBP－D9k)結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞另一側(cè);3)由基底膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞膜鈣泵1b和鈉鈣交換體1運(yùn)載出胞外排入血［8］。以上步驟受維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)的嚴(yán)格調(diào)控［9－10］。研究表明，CaBP－D9k、TRPV6 和 VDR 是 Ca2+跨膜吸收過(guò)程的主要限速大分子［9－11］?？梢?jiàn)，探索其在胃腸道的表達(dá)特征對(duì)深入研究Ca2+跨膜吸收動(dòng)力學(xué)具有重要的意義?，F(xiàn)有對(duì)十二指腸、空腸、回腸與Ca2+代謝相關(guān)基因的研究多集中于兔、羊、人，而對(duì)小鼠的報(bào)道不多［8，12－13］。因此，在已建立小鼠胃腸道CaBP-D9k、TRPV6和VDR基因檢測(cè)技術(shù)體系的基礎(chǔ)上，本研究探索這3個(gè)基因在胃腸道不同位點(diǎn)的表達(dá)模式，為闡明動(dòng)物胃腸道Ca2+吸收機(jī)制及深入探索該過(guò)程的調(diào)控因子奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

RNA樣本保存液(RNA Store)，總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(RT Reagent Kit with gDNA Eraser)和實(shí)時(shí)定量PCR(RT－qPCR)試劑盒(SYBRPremix Ex TaqTMⅡ)為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及采樣

選取12只8周齡雌性昆明小鼠(Mus musculus castaneus)為試驗(yàn)動(dòng)物，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，平均體重(30.71±2.93)g。飼養(yǎng)條件:溫度18～22℃，濕度50% ～60%，晝夜比例1∶1，自由采食及飲水。

小鼠購(gòu)進(jìn)適應(yīng)環(huán)境10 d后進(jìn)行試驗(yàn)。麻醉后心臟穿刺處死，快速分離胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸組織樣品(均為該組織中段)，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后投入RNA樣本保存液，－20℃凍存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第1鏈合成

應(yīng)用本課題組已建立的檢測(cè)技術(shù)體系提取小鼠總 RNA及合成 cDNA第1鏈［14］。Trizol法提取組織總RNA。電泳驗(yàn)證RNA完整性，核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)濃度。之后，將所有樣本濃度調(diào)整一致，采用反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄出cDNA第1鏈。經(jīng)分析，總RNA提取質(zhì)量良好，完整性高;各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均達(dá)到0.99，擴(kuò)增效率高于90%;熔解曲線峰呈單峰，滿足采用 2－ΔΔCt法進(jìn)行表達(dá)相對(duì)定量的條件。

1.2.2 RT－qPCR

參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。引物(表1)由大連寶生物工程有限公司合成。以β－肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參基因。SYBR GreenⅠ法(SYBRPremix Ex TaqTMⅡ)進(jìn)行RT－qPCR，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 、10min;95 ℃ 、15 s，60 ℃、60 s，40個(gè)循環(huán)。RT－qPCR反應(yīng)體系為:Premix Ex Taq(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板 cDNA 2 μL，加水至20 μL。以每個(gè)組織樣品的5個(gè)cDNA原液梯度稀釋后作模板，上機(jī)擴(kuò)增構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)定擴(kuò)增效率。同時(shí)，60～95℃進(jìn)行熔解曲線分析觀察產(chǎn)物特異性。

表1 引物序列及參數(shù)Table 1 Secquences and parameters of primers

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2－ΔΔCt法分析 CaBP-D9k、TRPV6、VDR mRNA在胃腸道不同片段中的表達(dá)量。以胃組織為對(duì)照樣本，計(jì)算小鼠胃腸道中CaBP-D9k、TRPV6、VDR mRNA 表達(dá)量［14］，公式為:

ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因;

mRNA 表達(dá)量 =2－(ΔCt目的樣本－ΔCt對(duì)照樣本)。

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SAS 9.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，調(diào)用 Proc NPar1Way模塊進(jìn)行Kruskal－Wallis檢驗(yàn)以比較不同組織間基因mRNA表達(dá)差異，差異顯著水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果

應(yīng)用 RT－qPCR檢測(cè)胃腸道6個(gè)不同片段CaBP-D9k、TRPV6、VDR mRNA 的表達(dá)量見(jiàn)圖 1，3個(gè)基因在小鼠胃腸道各組織中均有表達(dá)。

2.1 胃腸道CaBP-D9k mRNA表達(dá)量

由圖1－a可知，CaBP-D9k mRNA在盲腸的表達(dá)量顯著高于其他組織(P＜0.05)，其次是十二指腸，胃中表達(dá)量最低，這三者差異顯著(P＜0.05)。在小腸腸段(十二指腸、空腸、回腸)和大腸腸段(盲腸、結(jié)腸)內(nèi)，CaBP-D9k mRNA表達(dá)量均隨該段消化道的延伸而顯著降低(P＜0.05)。

2.2 胃腸道TRPV6 mRNA表達(dá)量

由圖1－b可知，盲腸、回腸TRPV6 mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織(P＜0.05)，二者差異不顯著(P＞0.05)。小腸前段(十二指腸)和大腸后段(結(jié)腸)TRPV6 mRNA表達(dá)量次之，顯著高于再次的空腸(P＜0.05)，胃內(nèi)TRPV6 mRNA表達(dá)量最低，顯著低于其他各組織(P＜0.05)。

2.3 胃腸道VDR mRNA表達(dá)量

由圖1－c可知，VDR mRNA表達(dá)量以盲腸內(nèi)最高，回腸最低，顯著低于其他各組織(P＜0.05)。各組織間VDR mRNA表達(dá)量大小依次為盲腸、十二指腸、空腸、結(jié)腸、胃、回腸。小腸腸段內(nèi)十二指腸與空腸內(nèi)VDR mRNA表達(dá)量接近，除回腸外的各組織VDR mRNA表達(dá)量差異均不顯著(P＞0.05)。

3 討論

動(dòng)物胃腸道各組織中 CaBP-D9K、TRPV6、VDR基因的分布具有特異性，它們?cè)贑a2+跨膜吸收中各有分工，協(xié)同調(diào)控這一過(guò)程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)［15］。本研究利用 RT－qPCR考察了鼠胃腸道6個(gè)不同片段的CaBP-D9K、TRPV6、VDR基因表達(dá)特征。從結(jié)果來(lái)看，這3個(gè)基因的特異表達(dá)使胃腸道不同片段表現(xiàn)出各自的Ca2+吸收特點(diǎn)。為便于比較，本文從消化道延伸先后順序的角度進(jìn)行討論。

3.1 胃 CaBP-D9K、TRPV6、VDR mRNA 的表達(dá)特征

總體來(lái)看，3個(gè)基因均在胃內(nèi)低水平表達(dá)，說(shuō)明胃不是Ca2+吸收調(diào)節(jié)的主要位點(diǎn)，對(duì)維持Ca2+穩(wěn)恒貢獻(xiàn)不大，與前人的研究結(jié)論類似［7，16］。這有利于將胃與其他組織比較，可能也是前人選取胃為分析對(duì)照樣本的原因。

圖1 小鼠胃腸道各段中CaBP-D9k、TRPV6和VDR mRNA表達(dá)量Fig.1 The mRNA expression levels of CaBP-D9k，TRPV6 and VDR in different intestinal segments of gastrointestinal tract in mice

3.2 小腸 CaBP-D9K、TRPV6、VDR mRNA 的表達(dá)特征

本研究發(fā)現(xiàn)，在小腸腸段，隨著十二指腸向空腸、回腸的延伸，CaBP-D9k與VDR mRNA表達(dá)量均降低。不同的是，TRPV6 mRNA主要定位于回腸，而在十二指腸表達(dá)量較低。

Ca2+通過(guò)跨膜及旁細(xì)胞2個(gè)途徑轉(zhuǎn)運(yùn)入血液，維持血鈣穩(wěn)恒。已知Ca2+的跨膜吸收能力受食糜滯留時(shí)間影響較小。經(jīng)典理論認(rèn)為，近端小腸是這一途徑的主要位點(diǎn);與前者相比，旁細(xì)胞途徑受胃腸道肌膜－漿膜Ca2+電化學(xué)濃度梯度差的調(diào)控，在腸道各片段均可發(fā)生［7］。食糜在十二指腸停留時(shí)間短(約為 2.5 min)［17］，主要經(jīng)跨膜吸收途徑快速攝取Ca2+。在飼糧鈣水平不足的情況下，十二指腸對(duì)代償性維持正常鈣吸收起重要作用，常伴有較高的Ca2+跨膜吸收相關(guān)基因表達(dá)。本研究中，在小鼠十二指腸中檢測(cè)到了小腸腸段中最高的CaBP-D9k、VDR與第2高的TRPV6 mRNA表達(dá)量，提示十二指腸是小腸內(nèi)Ca2+經(jīng)TRPV6入胞，在VDR調(diào)控下與CaBP-D9k特異結(jié)合，跨膜運(yùn)輸能力最強(qiáng)的位點(diǎn)。

食糜流經(jīng)十二指腸后，滯留時(shí)間逐漸延長(zhǎng)［17］，尤其在空腸后段，Ca2+的旁細(xì)胞吸收途徑作用開(kāi)始增強(qiáng)。這在本研究中得到了驗(yàn)證:即空腸(本研究所取空腸位點(diǎn)為中段)CaBP-D9k、TRPV6 mRNA表達(dá)量雖較胃高2倍以上，但仍顯著低于十二指腸;同時(shí)，與十二指腸相比，空腸VDR mRNA表達(dá)量亦下調(diào)了1.26倍。這說(shuō)明空腸的Ca2+跨膜攝取能力較十二指腸弱。回腸是Ca2+經(jīng)旁細(xì)胞途徑吸收的主要位點(diǎn)，食糜在此停留時(shí)間遠(yuǎn)長(zhǎng)于小腸其他部位［18－19］，Ca2+跨膜吸收相關(guān)基因表達(dá)量在該位點(diǎn)有所降低［18］。這與本研究結(jié)果相符，即小腸腸道內(nèi)以回腸的CaBP-D9k、VDR mRNA表達(dá)量最低。本研究未觀察到TRPV6 mRNA表達(dá)量在回腸中有顯著降低，這與前人的報(bào)道不一致［19－20］。其原因可能是，TRPV6 存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的機(jī)制，致使其蛋白質(zhì)合成量與mRNA表達(dá)量不相吻合［7，21］，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.3 大腸 CaBP-D9K、TRPV6、VDR mRNA 的表達(dá)特征

本研究發(fā)現(xiàn)，大腸CaBP-D9k、VDR mRNA的表達(dá)特征與小腸類似，即隨著腸段的延伸，CaBPD9k與VDR mRNA表達(dá)量均降低;而TRPV6 mRNA則主要在盲腸中表達(dá)。

盲腸是鼠類最主要的Ca2+吸收部位［22］，也是除近端小腸外的另一TRPV6基因高表達(dá)靶點(diǎn)［17，19］。鑒于盲腸的解剖生理長(zhǎng)度較短，食糜流經(jīng)速度快，因此，與十二指腸類似，盲腸內(nèi)Ca2+的吸收模式應(yīng)以跨膜途徑為主。本研究中，盲腸在整個(gè)胃腸道不同位點(diǎn)均有最高的CaBP-D9k、TRPV6、VDR mRNA表達(dá)量，表現(xiàn)出與其他胃腸道位點(diǎn)Ca2+吸收基因表達(dá)不同的特殊性，提示其Ca2+跨膜吸收能力甚至超過(guò)十二指腸。食糜流經(jīng)盲腸后的吸收量對(duì)整個(gè)胃腸道Ca2+吸收貢獻(xiàn)十分有限，伴隨著較低的Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)。據(jù)此，作者推測(cè)，盲腸的Ca2+跨膜吸收起著重要作用，這一位點(diǎn)的Ca2+攝取能力可能是影響整個(gè)消化道Ca2+攝取的關(guān)鍵。在本研究中，結(jié)腸CaBPD9k、VDR mRNA表達(dá)量低于十二指腸，提示結(jié)腸Ca2+跨膜吸收能力較十二指腸弱。正常情況下，結(jié)腸在整個(gè)胃腸道內(nèi)Ca2+吸收比例不到10%［23］，以跨膜途徑攝取 Ca2+為主［18］，受 VDR 調(diào)控［24］?？v觀目前的文獻(xiàn)，結(jié)腸的Ca2+吸收機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

胃腸道吸收是動(dòng)物攝取Ca2+最重要的途徑［3］。其時(shí)空表達(dá)模式的差異可導(dǎo)致消化道不同片段Ca2+吸收模式及動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化，繼而調(diào)節(jié) Ca2+吸收能力，最終影響機(jī)體 Ca2+穩(wěn)恒狀態(tài)［2，16，21］。明確動(dòng)物胃腸道 Ca2+吸收這一生理過(guò)程的調(diào)控模式及途徑，對(duì)從本質(zhì)上揭示動(dòng)物Ca2+代謝紊亂的機(jī)理及其防治措施具有重要的意義。為此，考察其胃腸道Ca2+吸收調(diào)控因子表達(dá)特征成為開(kāi)展后續(xù)研究工作的基礎(chǔ)。本研究旨在先行報(bào)道處于Ca2+穩(wěn)恒狀態(tài)下動(dòng)物胃腸道Ca2+跨膜吸收蛋白編碼mRNA的表達(dá)分布情況，獲取基線數(shù)據(jù)，這可為進(jìn)一步考察Ca2+跨膜吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)和調(diào)控動(dòng)物胃腸道Ca2+吸收效率的研究提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

① CaBP-D9k、TRPV6和VDR mRNA在胃內(nèi)屬低水平表達(dá)，而在盲腸內(nèi)表達(dá)量較高。

② 隨著小腸的延伸，CaBP-D9k、VDR mRNA表達(dá)量逐漸降低，而TRPV6 mRNA則在回腸內(nèi)高水平表達(dá)。

③ CaBP-D9k、VDR、TRPV6 mRNA 的表達(dá)量隨著大腸腸段的延伸而不同程度地下降。

④ CaBP-D9k、TRPV6和 VDR mRNA表達(dá)量與胃腸道Ca2+跨膜吸收能力存在關(guān)聯(lián)性。

［1］ WU W X，LIU J X，XU G Z，et al.Calcium homeo－stasis，acid－base balance，and health status in periparturient Holstein cows fed diets with low cation－anion difference［J］.Livestock Science，2008，117(1):7 －14.

［2］ PéREZ AV，PICOTTO G，CARPENTIERI A R，et al.Minireview on regulation of intestinal calcium absorption.Emphasis on molecular mechanisms of transcellular pathway［J］.Digestion，2008，77(1):22 － 34.

［3］ MARTIN－TERESO J，VERSTEGEN M W.A novel model to explain dietary factors affecting hypocalcaemia in dairy cattle［J］.Nutrition Research Reviews，2011，24(2):228 －143.

［4］ BRONNER F，PANSU D，STEIN W D.An analysis of intestinal calcium transport across the rat intestine［J］.The American Journal of Physiology，1986，250(5):G561－G569.

［5］ BRONNER F.Mechanisms of intestinal calcium absorption［J］.Journal of Cellular Biochemistry，2003，88(2):387－393.

［6］ BOUILLON R，VAN CROMPHAUT S，CARMELIET G.Intestinal calcium absorption:molecular vitamin D mediated mechanisms［J］.Journal of Cellular Biochemistry，2003，88(2):332 －339.

［7］ HOENDEROPJ G，NILIUS B，BINDELS R J.Calcium absorption across epithelia［J］.Physiological Reviews，2005，85(1):373 －422.

［8］ WILKENS M R，MROCHEN N，BREVES G，et al.Gastrointestinal calcium absorption in sheep is mostly insensitive to an alimentary induced challenge of calcium homeostasis［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology，2011，158(3):199 －207.

［9］ BALESARIA S，SANGHA S，WALTERSJR.Human duodenum responses to vitamin D metabolites of TRPV6 and other genes involved in calcium absorption［J］.American Journal of Physiology:Gastrointestinal and Liver Physiology，2009，297(6):G1193 －G1197.

［10］ BRONNER F.Recent developments in intestinal calcium absorption［J］.Nutrition Reviews，2009，67(2):109－113.

［11］ 那鍵.雌激素、維生素D3對(duì)雌性大鼠成骨細(xì)胞增殖及鈣通道TRPV5/TRPV6表達(dá)的影響［D］.博士學(xué)位論文.長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2009:47－65.

［12］ WILKENS M R，KUNERT－KEIL C，BRINKMEIER H，et al.Expression of calcium channel TRPV6 in ovine epithelial tissue［J］.The Veterinary Journal，2009，182(2):294 －300.

［13］ LIEBEN L，BENN B S，AJIBADE D，et al.TRPV6 mediates intestinal calcium absorption during calcium restriction and contributes to bone homeostasis［J］.Bone，2010，47(2):301 －308.

［14］ WILLEMS E，VANDESOMPELE L L J.Standardization of real－time PCR gene expression data from independent biological replicates［J］.Analytical Biochemistry，2008，379(1):127 －129.

［15］ SU A I，WILTSHIRE T，BATALOV S，et al.A gene atlas of the mouse and human protein－encoding transcriptomes［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2004，101(16):6062 －6067.

［16］ SUZUKI Y，LANDOWSKI C P，HEDIGER M A.Mechanisms and regulation of epithelial Ca2+absorption in health and disease［J］.Annual Review of Physiology，2008，70:257 －271.

［17］ KHANAL R C，NEMERE I.Regulation of intestinal calcium transport［J］.Annual Review of Nutrition，2008，28:179 －196.

［18］ SIDLER－LAUFF K，BOOS A，KRAENZLIN M，et al.Influence of different calcium supplies and a single vitamin D injection on vitamin D receptor and calbindin D9k immunoreactivities in the gastrointestinal tract of goat kids［J］.Journal of Animal Science，2010，88(11):3598 －3610.

［19］ NIJENHUIST，HOENDEROPJG，VAN DER KEMP A W，et al.Localization and regulation of the epithelial Ca2+channel TRPV6 in the kidney［J］.Journal of the American Society of Nephrology，2003，14(11):2731－2740.

［20］ SPREKELER N，MULLER T，KOWALEWSKI M P，et al.Expression patterns of intestinal calcium transport factors and ex-vivo absorption of calcium in horses［J］.BMC Veterinary Research，2011，7(1):65 －76.

［21］ WALTERS J R，BALESARIA S，CHAVELE K M，et al.Calcium channel TRPV6 expression in human duodenum:different relationships to the vitamin D system and aging in men and women［J］.Journal of Bone and Mineral Research，2006，21(11):1770 －1777.

［22］ KARBACH U，F(xiàn)ELDMEIER H.The cecum is the site with the highest calcium absorption in rat intestine［J］.Digestive Diseases and Sciences，1993，38(10):1815－1824.

［23］ WASSERMAN R H.Vitamin D and the dual processes of intestinal calcium absorption［J］.The Journal of Nutrition，2004，134(11):3137 －3139.

［24］ WALI R K，BAUM C L，SITRIN M D，et al.1，25(OH)2vitamin D3stimulates membrane phosphoinositide turnover，activates protein kinase C，and increases cytosolic calcium in rat colonic epithelium［J］.The Journal of Clinical Investigation，1990，85(4):1296－1303.