王永娟， 左偉勇， 王安平， 吳 雙， 朱善元

(江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease， IBD)是一種引起世界養(yǎng)禽業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失的傳染病，能導(dǎo)致雞不同程度的病理變化、死亡和免疫抑制［1］。目前IBD的免疫主要通過疫苗進(jìn)行，但由于活疫苗免疫能導(dǎo)致雞法氏囊的凋亡和毒力增強(qiáng)而影響免疫效果［1-2］，所以有必要開發(fā)防治IBD的新方法。作為一種新型抗病毒感染策略，RNA干擾(RNA interference，RNAi)具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，已被眾多學(xué)者用于病毒病研究，能抑制幾乎所有屬病毒的復(fù)制［3］，因此具有十分誘人的應(yīng)用前景。

VP2是雞傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)的主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在病毒包裝、細(xì)胞吸附、免疫應(yīng)答過程中都起重要作用［4-6］，所以目前疫苗相關(guān)的研究主要針對VP2蛋白質(zhì)。miRNA作為一種小RNA已被證實(shí)能抑制病毒基因的表達(dá)［7-8］。本研究在前期研究［7］基礎(chǔ)上，研究 vp2基因特異miRNA在抗性篩選之后對于病毒基因轉(zhuǎn)錄子及病毒滴度的影響，為RNAi技術(shù)在IBD防治中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 各種酶、DNA Marker購自大連寶生物公司;Wizard DNA Clean-up System購自Promega公司;常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純;DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司;Trizol為北京鼎國公司產(chǎn)品;PEI、G418購自Sigma公司;MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自BBI公司。倒置顯微鏡為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要生物材料 pTarget載體購自大連寶生物公司;pRFPRNAiC購自英國Das R M教授;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α由本室保存;DF-1細(xì)胞系(ATCC CRL-12203)、pCR-AAAV 載體、pRFPRNA-iVP2A、pRFPRNAiVP2E、pRFPRNA iVP2con 由本實(shí)驗(yàn)室保存;IBDV Lurkert株由孫懷昌教授提供。

1.2 miRNA雙表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)pRFPRNAiC［1］中第二發(fā)夾設(shè)計(jì)要求合成通用引物及miVP2E表達(dá)引物(表1)。在通用引物兩端分別引入Mlu I和 Sph I位點(diǎn)，在已有pRFPRNAiVP2A 的基礎(chǔ)上［7］參考文獻(xiàn)［9］的方法獲得雙表達(dá)載體pRFPRNAiVP2AE。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 miRNA抗性選擇載體構(gòu)建

以PCR法擴(kuò)增pTarget質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)兩端引入的PmlⅠ和BsmBⅠ雙酶切后，與 pCRAAAV載體相連獲得pAITR-MCS2;pTarget質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ和Not I雙酶切后自連獲得新載體pT;EcoRⅠ酶切pAITR-MCS2與pT，分別回收含ITR和MCS2的片段與pT片段，最終獲得抗性選擇載體pTITR。

用Sal I和 BamH I雙酶切 pRFPRNAiVP2A、pRFPRNAiVP2E及 pRFPRNAiVP2AE，將 miRNA表達(dá)盒連同RFP表達(dá)盒從pRFPRNAiC載體切出，分別插入同樣酶切的pTITR載體，獲得pTITR-miVP2A和 pTITR-miVP2E、pTITR-miVP2AE，同時(shí)設(shè) pTITR-miVP2con對照。

1.4 DF-1細(xì)胞抗G418最小致死量確定

按每孔104個(gè)DF-1細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)24 h后，分 別 用 終 濃 度 為 0 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml、400 μg/ml、500 μg/ml、600 μg/ml、700 μg/ml、800 μg/ml、900 μg/ml、1 000 μg/ml的G418培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d換液1次，以細(xì)胞最先全部死亡孔的G418濃度為最低致死劑量。

1.5 抗性細(xì)胞篩選

將DF-1細(xì)胞以每瓶2×106個(gè)的密度接種25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為70%時(shí)吸棄培養(yǎng)液。分別取 4 μg pTITR-miVP2A、pTITR-miVP2E、pTITR-miVP2AE及pTITR-miVP2con按照文獻(xiàn)［10］方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，每個(gè)樣做4個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染后24 h，以含最低致死劑量G418的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d換液1次，1周后進(jìn)行病毒感染。

1.6 有效miRNA的表達(dá)檢測

在轉(zhuǎn)染后48 h，Trizol法提取細(xì)胞總 RNA，用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miRNA的表達(dá)。

1.7 病毒感染

在抗性標(biāo)記miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染和G418篩選后約1周，至在熒光顯微鏡中觀察到細(xì)胞基本均為RFP陽性細(xì)胞為止，按照常規(guī)胰酶消化法分散細(xì)胞，以每孔105個(gè)的密度分別接種24孔板，用IBDV Lukert株的DF-1細(xì)胞適應(yīng)病毒感染(n=3)，分別用0.001、0.010、0.100 個(gè) TCID50的病毒量，吸附 2 h 后棄病毒液，換為含1% 新生牛血清的DMEM維持液。

1.8 miRNA抑制效率檢測

1.8.1 病毒滴度測定 參考文獻(xiàn)報(bào)道的有限稀釋法［11］，在病毒感染后 48 h 時(shí)吸取 100 μl細(xì)胞上清液進(jìn)行IBDV TCID50測定，以空載體轉(zhuǎn)染、IBDV單獨(dú)感染細(xì)胞為對照，計(jì)算有效miVP2對IBDV復(fù)制的抑制作用。

1.8.2 vp2基因RT-PCR檢測 按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法［12］在病毒感染48 h后提取病毒基因組，然后以O(shè)ligo(dT)18為引物進(jìn)行RT反應(yīng)。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行vp2基因轉(zhuǎn)錄子的半定量RT-PCR檢測。vp2擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行，內(nèi)參引物序列見表1，21個(gè)循環(huán)擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 45 s(第1個(gè)循環(huán)為4 min)，52℃ 40 s，72℃ 40 s(最后 1個(gè)循環(huán)10 min)。PCR結(jié)束后，各取5 μl產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后用ND-1000分光光度計(jì)對各條帶進(jìn)行灰度掃描，并計(jì)算vp2與內(nèi)參擴(kuò)增產(chǎn)物的比例。

2 結(jié)果

2.1 miRNA雙表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

利用DNA重組技術(shù)，根據(jù)pRFPRNAiC的表達(dá)要求，獲得vp2基因特異的miRNA表達(dá)載體pRFPRNAmiVP2AE，其雙酶切(BamH I、Kpn I)鑒定結(jié)果見圖1，pRFPRNAiVP2AE可以切出約370 bp的條帶，而pRFPRNAiVP2A對照只切出270 bp的條帶。

圖1 pRFPRNAiVP2AE的酶切鑒定Fig.1 Identification of pRFPRNAiVP2AE by restriction enzyme

2.2 miRNA抗性選擇載體構(gòu)建與鑒定

利用DNA重組技術(shù)，將構(gòu)建好的miRNA單表達(dá)或雙表達(dá)載體與經(jīng)過改造的含neo基因的miRNA表達(dá)載體pTITR(圖2)重組，獲得可用于G418篩選的 miRNA 表達(dá)載體 pTITR-miVP2A、E、con、AE，以pTITR-miVP2A為例的酶切鑒定結(jié)果見圖3。

圖2 pTITR的酶切鑒定Fig.2 Identification of pTITR by restriction enzyme

2.3 有效miRNA的表達(dá)檢測

為確定基因或病毒的抑制作用確實(shí)由表達(dá)的miRNA所產(chǎn)生，在miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后48 h，提取各孔細(xì)胞總RNA，DNase I消化后，以構(gòu)建miRNA的通用正、反向引物進(jìn)行RT-PCR檢測，可見預(yù)期的150 bp左右特異條帶，而未轉(zhuǎn)染組則無此條帶(圖4)。

2.4 穩(wěn)定表達(dá)miRNA對IBDV復(fù)制的抑制效果

圖3 pTITR-miVP2A的酶切鑒定Fig.3 Identification of pTITR-miVP2A by restriction enzyme

圖4 DF-1中有效miRNA的表達(dá)檢測Fig.4 Detection of miRNA expression in vector-transfected DF-1cells

將miRNA抗性選擇載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，后經(jīng)最小致死劑量G418(400 μg/ml)篩選1周、感染不同劑量IBDV后48 h，測得miRNA表達(dá)陽性組的病毒TCID50在空白對照組pRFPRNAmivp2con之間無明顯差異，而與pTITR-miVP2A、pTITR-miVP2E和pTITR-miVP2AE轉(zhuǎn)染組有明顯差異，分別下降6lg2、5lg2和6lg2。不同感染劑量的病毒復(fù)制抑制效果無明顯差異，0.1個(gè)TCID50的病毒抑制效果見圖5。

2.5 穩(wěn)定表達(dá)miRNA對vp2轉(zhuǎn)錄子的抑制效果

提取病毒感染48 h后的細(xì)胞總RNA，在同等條件下以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行vp2的半定量RT-PCR檢測。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離和EB染色后，對目的條帶進(jìn)行灰度掃描，3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值見圖6。從圖6中也可以看到，與空白對照組和pRFPRNAmivp2con轉(zhuǎn)染組相比，pTITR-miVP2A、pTITR-miVP2E和pTITR-miVP2AE轉(zhuǎn)染細(xì)胞的vp2基因表達(dá)抑制率分別為80.7%、77.5%和75.0%。

圖5 TCID50法測定miRNA對病毒復(fù)制的抑制效果Fig.5 The inhibitory effect of miRNA on viral replication revealed by TCID50

圖6 半定量RT-PCR測定miRNA對vp2基因表達(dá)的抑制效果Fig.6 The inhibitory effect on vp2 gene expression delivered by miRNA detected by semi-quantitative RT-PCR

3 討論

本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上構(gòu)建了抗性標(biāo)記miRNA表達(dá)載體pTITR載體，可供vp2基因特異miRNA的表達(dá)篩選以獲得穩(wěn)定整合細(xì)胞克隆。試驗(yàn)結(jié)果表明，效果最明顯的miVP2A的vp2基因表達(dá)沉默效果為80.7%，可使病毒TCID50下降5～6lg2，而含4個(gè)堿基錯(cuò)配的對照miVP2con無明顯的抑制作用，這一試驗(yàn)結(jié)果不僅說明前期篩選到的2個(gè)vp2基因特異miRNA在篩選過的細(xì)胞系中均能有效抑制病毒復(fù)制，為RNAi技術(shù)在IBD防治中的進(jìn)一步用應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，而且證實(shí)了miRNA基因沉默作用的序列特異性，排除由雙鏈RNA誘導(dǎo)的干擾素作用的可能性。

從對病毒基因的抑制效率看，抑制效率在75%以上，即使在最優(yōu)化條件下，細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率也難以達(dá)到如此高的水平，這提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的miRNA存在跨細(xì)胞傳遞的可能性［13］。然而，不管是之前非抗性標(biāo)記miRNA表達(dá)載體與報(bào)告載體的共轉(zhuǎn)染［7］，還是本試驗(yàn)所用抗性篩選獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行研究，vp2基因表達(dá)和病毒復(fù)制抑制率均未達(dá)到完全抑制，其原因可能有:(1)就目前的RNAi技術(shù)而言，很難實(shí)現(xiàn)100%的抑制，這方面的報(bào)道很多，例如，用本研究所用的RNAi載體系統(tǒng)、以GFP或LacZ為報(bào)告基因的研究結(jié)果顯示，基因表達(dá)抑制效率為90%左右［9］;(2)通過篩選更多的靶序列，有可能獲得抑制效果更佳的siRNA或miRNA，值得今后進(jìn)一步研究;(3)VP2為主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，約占病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的50%，提示vp2基因的轉(zhuǎn)錄水平高，即使細(xì)胞內(nèi)有足夠量siRNA的存在，也可能難以完全阻止部分VP2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯。因此，選擇轉(zhuǎn)錄水平較低的基因(如vp1)為干擾靶序列，有可能進(jìn)一步提高基因沉默效果，但已有報(bào)道顯示，以vp1作為干擾IBDV復(fù)制的靶序列，抑制效率也僅為90%左右［8］。

本研究所用的載體主要是pTITR和pRFPRNAiC，pTITR這一載體帶有禽腺聯(lián)病毒(AAAV)末端反向重組序列(ITR)，可用于后續(xù)重組AAAV的構(gòu)建。pRFPRNAiC能同時(shí)表達(dá)針對相同或不同基因的2個(gè)miRNA，在理論上，不僅可增強(qiáng)基因沉默效果，而且能在一定程度上避免因病毒變異而引起的干擾作用逃脫。為了證明這一觀點(diǎn)，本研究將2個(gè)有效的miRNA同時(shí)克隆入表達(dá)載體，并在IBDV感染之前對其轉(zhuǎn)染細(xì)胞用G418篩選。半定量和病毒滴度測定結(jié)果顯示，miRNA雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組的抑制率略低于單表達(dá)組，其可能原因是過量表達(dá)的miRNA使RISC處于飽和狀態(tài)，miVP2A與miVP2E競爭與RISC結(jié)合，這一觀點(diǎn)與其他學(xué)者所提出的提高siRNA的劑量反而導(dǎo)致抑制效率下降［14-16］理論相吻合。另有研究資料表明，高劑量siRNA有可能誘導(dǎo)一系列未知酶的表達(dá)，從而限制或完全降解siRNA［15］。這些研究資料提示，在進(jìn)行RNAi研究時(shí)，同樣需要對siRNA表達(dá)水平等試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的抑制效果。

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