邢玉娟， 陳玉庫(kù)， 胡元亮， 王德云， 陳 茜， 郭振環(huán)， 王君敏， 趙曉娜

(1.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)研究室，江蘇 南京 210095)

研究證明，中藥作為一種免疫增強(qiáng)劑，具有來(lái)源廣泛、效果顯著、無(wú)毒副作用等優(yōu)勢(shì)，不僅能克服油乳類(lèi)、鋁膠類(lèi)化學(xué)佐劑副作用大、局部刺激重、致癌、制備和使用麻煩或不能足夠提高弱抗原的免疫原性等弊?。?-2］，而且能顯著增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育和細(xì)胞因子的分泌［3-4］。

在以前的研究中，筆者首先通過(guò)體外試驗(yàn)篩選出氧化苦參堿(OM)、黃芪多糖(APS)等具有顯著抑制新城疫病毒(NDV)增殖作用的中藥成分，然后比較了中藥成分復(fù)方體外抗NDV感染的效果，結(jié)果表明中藥成分復(fù)方無(wú)論是高濃度，還是中、低濃度都能顯著抑制NDV感染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)［5］。通過(guò)臨床試驗(yàn)比較了中藥成分復(fù)方對(duì)雛雞人工感染新城疫的療效，結(jié)果表明，在攻毒前、與攻毒同時(shí)和攻毒后給藥，中藥成分復(fù)方均能顯著降低受試雞的死亡率，提高血清NDV抗體效價(jià)，減輕死亡雞的器官出血［6］。

本試驗(yàn)在測(cè)定了OM、APS、甘草酸(GA)、桅子苷(GP)等4種中藥成分體外對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，篩選出具有較好增強(qiáng)免疫效果的OM和APS基礎(chǔ)上，擬使用OM和APS的中藥成分復(fù)方OM-APS(OAP)及其組分藥配合新城疫疫苗免疫，測(cè)定雛雞免疫后外周血T淋巴細(xì)胞增殖、血清抗體效價(jià)和細(xì)胞因子的變化，旨在闡明中藥成分復(fù)方免疫增強(qiáng)的作用機(jī)理，為研制中藥成分免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物準(zhǔn)備

根據(jù)以前的試驗(yàn)結(jié)果［5-6］，分別用雙蒸水將OM、APS 和 OM-APS(OAP)稀釋成 4 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml，分別代表高、中、低 3 種濃度，常規(guī)消毒后備用。

1.2 疫苗和病毒

新城疫Ⅳ系(Newcastle Disease virusⅣ strain，NDV-Ⅳ)疫苗，中牧股份南京藥械廠生產(chǎn)，批號(hào)753-3。新城疫檢測(cè)抗原，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)研究室提供。

1.3 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品，按說(shuō)明書(shū)用三蒸水配制后過(guò)濾除菌，分裝，4℃保存，臨用前加入犢牛血清達(dá)5%和青霉素、鏈霉素各100 IU/ml;植物血凝素(PHA)，上海伊華科技有限公司產(chǎn)品，用 RPMI1640培養(yǎng)液配制成 0.1 mg/ml，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后－20℃保存;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)溶液，Amresco公司產(chǎn)品，用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，使終濃度為5 mg/ml，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后4℃冰箱避光保存;淋巴細(xì)胞分離液，上海恒信化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞裂解液，二甲基亞砜(DMSO)，分析純，蘇州正興化工研究院產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡非免疫健康羅曼蛋公雞700羽，購(gòu)自南京湯泉農(nóng)墾種雞場(chǎng)。試驗(yàn)期間采用籠養(yǎng)，全價(jià)飼料，自由采食和飲水，1～14日齡采用紅外燈保溫，全日制光照。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

雛雞飼養(yǎng)至14日齡去除病弱雞，選取660羽［平均體重95 g，平均母源抗體效價(jià)(2.4±0.5)lg2］，隨機(jī)均分為11組。第1～9組為OAP高劑量組(OAPH)、OAP中劑量組(OAPM)、OAP低劑量組(OAPL)、OM高劑量組(OMH)、OM中劑量組(OMM)、OM 低劑量組(OML)、APS高劑量組(APSH)、APS中劑量組(APSM)和 APS低劑量組(APSL)，第10組為疫苗對(duì)照組，第11組為空白對(duì)照組。除空白對(duì)照組外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、點(diǎn)眼免疫，每羽1份。28日齡二免。在首次免疫的同時(shí)，3個(gè)中藥復(fù)方組分別口服高、中、低劑量的OAP、OM和APS，免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組口服等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。在首次免疫同時(shí)，分別于14、21、28、35、42 日齡采血，抗凝血 MTT 法測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞增殖，非抗凝血血清用β-微量法測(cè)定HI抗體效價(jià)。于14、28、42日齡，采血分離血清，用ELISA方法檢測(cè)IL-2和IFN-γ的含量。

1.6 淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定方法

采用MTT法［3-4］測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖情況。將抗凝血樣(每羽2 ml)用Hank’s液稀釋1倍，小心加在淋巴細(xì)胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，吸取中間云霧狀白細(xì)胞層，用無(wú)血清RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液洗2遍，每分鐘1 500 r/min離心15 min。臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)，活細(xì)胞大于90%后，用RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ml 2.5×106個(gè)，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(德國(guó)Nunclon公司生產(chǎn))中，每孔80 μl，再加20 μl PHA，每個(gè)樣品重復(fù) 4 孔，然后置于39.5℃、5%CO2條件下(CO2培養(yǎng)箱，美國(guó) Revco 公司產(chǎn)品)培養(yǎng)44 h，每孔加入 MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加裂解液100 μl，將細(xì)胞板置于微量振蕩器(75-2A型，上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn))上振蕩5 min使沉淀完全溶解，在酶聯(lián)免疫儀(DG-3022型，中國(guó)華東電子管廠生產(chǎn))上檢測(cè)570 nm處的吸光值(A570)作為T(mén)淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

1.7 抗體效價(jià)測(cè)定方法

在96孔微量血凝板上，從左到右每孔各加50 μl PBS液，再向每排的第1孔加入50 μl待檢血清，依次向后倍比稀釋直至第12孔，然后向每孔加入50 μl 4個(gè)單位的抗原，在微量振蕩器上振蕩混勻后置于溫箱中感作20 min。取出向每孔加入50 μl雞紅細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性血清、陰性血清及空白對(duì)照孔。振蕩混勻后置于37℃溫箱中感作30 min，待對(duì)照孔紅細(xì)胞已經(jīng)沉淀時(shí)觀察結(jié)果［7］。

1.8 IL-2 和 IFN-γ 的測(cè)定

分離血清后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定IL-2和IFN-γ的含量。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS軟件12.0統(tǒng)計(jì)分析，比較各組間的差異性。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞增殖的變化

從表1可以看出，免疫組各時(shí)間點(diǎn)A570值均顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。OAPH、OAPM、OMH、OMM、APSH、APSM在雛雞各日齡段，OAPL和APSL在 21、28、35 和 42 日齡，OML在 21、28 和 42日齡的A570值顯著高于免疫對(duì)照組;OAPH在雛雞各日齡段，A570值均顯著高于 OMH和 APSH(P＜0.05);OAPM在28日齡 A570值高于 APSM，但差異不顯著，其余日齡段 A570值均顯著高于 OMM和APSM(P ＜0.05);復(fù)方組(OAPH、OAPM、OAPL)和OMH、APSH在21日齡A570值達(dá)到高峰，其余各單味藥對(duì)照組在28日齡達(dá)到高峰。

表1 淋巴細(xì)胞的增殖Table 1 Proliferations of T lymphocytes

2.2 抗體效價(jià)的變化

從表2可以看出，所有處理抗體效價(jià)均顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05);OAPH、OAPM在雛雞14日齡，OMH、OMM在 21 日齡，OAPH、OAPM、OAPL、OMM和 APSM在 28 日齡，OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在 35 日齡，OAPH、OAPM、APSM在 42 日齡抗體效價(jià)顯著高于免疫對(duì)照組;OAPH的抗體效價(jià)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于OMH和APSH(P＜0.05);OAPM抗體效價(jià)在21、28、35、42 日齡顯著高于OMM，21、28和35日齡顯著高于APSM(P＜0.05);OAPL抗體效價(jià)在28日齡顯著高于OML(P＜0.05)。

表2 血清抗體效價(jià)的變化(lg2)Table 2 Changes of the serum antibody titers(lg2)

2.3 血清中IL-2水平的變化

從表3可以看出，所有免疫組血清IL-2濃度均顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05);OAPH、OAPM、OAPL、OMH、OMM、APSH、APSM在各日齡段、OML在42日齡、APSL在14和42日齡血清IL-2濃度均顯著高于免疫對(duì)照組(P＜0.05);OAPH在各日齡段血清IL-2濃度均顯著高于OMH和APSH，OAPM在各日齡段血清IL-2濃度均顯著高于OMM和APSM，OAPL在28、42日齡血清 IL-2濃度顯著高于 OML和 APSL(P＜0.05)。APSL和空白對(duì)照組血清中IL-2濃度在14日齡達(dá)到高峰，然后下降，其余各組均在28日齡達(dá)到峰值。

表3 血清中IL-2濃度的變化Table 3 Changes of IL-2 concentrations in serum

2.4 血清中IFN-γ 水平的變化

從表4可以看出，口服中藥的9個(gè)處理在雛雞各日齡段血清IFN-γ濃度均顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05);OAPH、OAPM在雛雞各日齡段血清IFN-γ濃度均顯著高于免疫對(duì)照組(P＜0.05)。APSH、APSM在28和42日齡，OAPL在42日齡，OMM在42日齡血清IFN-γ濃度均顯著高于免疫對(duì)照組(P＜0.05)。OAPH在雛雞各日齡段血清IFN-γ濃度均顯著高于OMH和APSH，OAPM在28、42日齡血清IFN-γ濃度顯著高于 OMM和 APSM(P＜0.05)。OAPL、OMH、OMM、OML、APSL和免疫對(duì)照組血清中 IFN-γ濃度在14日齡達(dá)到高峰，然后下降，其余各組均在28日齡達(dá)到峰值。

表4 血清中IFN-γ濃度的變化Table 4 Changes of IFN-γ concentrations in serum

3 討論

3.1 中藥成分復(fù)方及其組分藥對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫的影響

淋巴細(xì)胞增殖是反映機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一個(gè)重要指標(biāo)［7］。細(xì)胞免疫可以通過(guò)致敏淋巴細(xì)胞與相應(yīng)抗原作用而發(fā)揮抗病原體感染、抗腫瘤、幫助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體等作用。唐雪明和孔祥峰等也通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)黃芪多糖及其復(fù)方具有提高雞淋巴細(xì)胞增殖的作用，并且具有一定的劑量效應(yīng)［8-9］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與免疫對(duì)照組比較，OAP、OM、APS均具有增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖的作用，高劑量的效果優(yōu)于低劑量。

血清抗體效價(jià)反映機(jī)體體液免疫狀態(tài)，體液免疫是機(jī)體抗御感染的主要因素之一，通過(guò)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)而起到抗菌、抗病毒、抗外毒素等多種作用［10］。王德云等亦研究報(bào)道黃芪多糖及其復(fù)方等具有提高機(jī)體特異性抗體的效果，高劑量促進(jìn)抗體生成的作用強(qiáng)于低劑量［7］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與免疫對(duì)照組比較，OAP、OM、APS均具有提高新城疫特異性抗體的作用，增強(qiáng)機(jī)體體液免疫的效果，且高劑量效果優(yōu)于低劑量。

3.2 中藥成分復(fù)方及其組分藥對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響

細(xì)胞因子是一類(lèi)主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的極微量的具有廣譜生物學(xué)活性的小分子肽，是免疫系統(tǒng)重要調(diào)節(jié)因子，病原感染或疫苗接種產(chǎn)生的細(xì)胞因子決定免疫反應(yīng)的類(lèi)型和程度。IL-2是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，可以輔助CTL細(xì)胞表達(dá)殺傷功能，IFN-γ是由T淋巴細(xì)胞不同的亞群分泌的免疫調(diào)節(jié)因子，具有廣泛抗病毒、抗腫瘤和雙向免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對(duì)不同免疫細(xì)胞間相互作用和發(fā)揮免疫功能具有重要的介導(dǎo)作用［11］。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，OAP、OM、APS均具有促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，提高血清中IL-2和IFN-γ濃度的作用。并且在選用的劑量中，高劑量和中劑量組在雛雞多個(gè)日齡段提高血清中2種細(xì)胞因子濃度的作用強(qiáng)于低劑量。馬霞、王德云、陳玉庫(kù)等也通過(guò)試驗(yàn)證明，黃芪多糖、氧化苦參堿和黃酮等中藥成分及其復(fù)方體內(nèi)外均具有促進(jìn)IL-2、IL-6和IFN-γ等細(xì)胞因子分泌，攻毒保護(hù)試驗(yàn)也表明細(xì)胞因子高劑量用藥組保護(hù)率也相應(yīng)高于低劑量用藥組［12-14］。

3.3 復(fù)方增強(qiáng)免疫作用與單味組分藥的比較

本試驗(yàn)結(jié)果表明，OAP是由OM和APS組成的復(fù)方，在促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、提高特異性抗體生成、增加細(xì)胞因子分泌等增強(qiáng)免疫作用方面，同等劑量復(fù)方多優(yōu)于單味組分藥，表明兩種組分藥有協(xié)同作用。王德云等研究當(dāng)歸多糖、黃芪多糖及其復(fù)方等對(duì)培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖、抗體生成、細(xì)胞因子分泌的影響，也得到相似結(jié)果［7，13］。范云鵬等研究中藥成分黃酮及其復(fù)方增強(qiáng)免疫作用時(shí)，也發(fā)現(xiàn)復(fù)方的作用效果優(yōu)于單味成分［15］。研究只報(bào)道了中藥或中藥成分復(fù)方的生物活性高于其單味藥的現(xiàn)象，這可能與中獸醫(yī)的配伍理論有關(guān)，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜合以上結(jié)果，OAP增強(qiáng)雛雞對(duì)新城疫疫苗的免疫效果最好，可作為新型免疫增強(qiáng)劑的候選藥方。鑒于中、高劑量的效果多差異不顯著，推薦臨床使用OAP中劑量配合疫苗使用。

［1］韓慶功，崔艷紅，趙玉軍.免疫增強(qiáng)劑在雞疫病防治中的應(yīng)用［J］.獸藥與飼料添加劑，2006，11(2):19-22.

［2］龔曉明，吳耀妹.免疫佐劑研究的現(xiàn)狀與趨勢(shì)［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，1996，30(1):41-43.

［3］郭振環(huán)，胡元亮，馬 霞，等.硫酸化香菇多糖對(duì)新城疫疫苗免疫效果的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(1):76-80.

［4］MA X，GUO Z H，WANG D Y，et al.Effects of sulfated polysaccharides and their prescriptions on immune response of ND vaccine in chicken［J］.Carbohydrate Polymers，2010，82:9-13.

［5］陳玉庫(kù)，邢玉娟，蔡丙彥.四種中藥成分復(fù)方抗NDV感染CEF細(xì)胞篩選效果分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(5):176-179.

［6］邢玉娟，陳玉庫(kù)，蔡丙彥，等.氧化苦參堿-黃芪多糖復(fù)方防治雞新城疫的效果觀察［J］.畜牧與獸醫(yī)，2009(1):91-93.

［7］WANG D Y，HU Y L，SUN J L，et al.Comparative study on adjuvanticity of compound Chinese herbal medicinal ingredients［J］.Vaccine，2005，23(28):3704-3708.

［8］唐雪明，胡元亮，張寶康，等.黃芪多糖對(duì)雛雞外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，18(3):269-271.

［9］孔祥峰，胡元亮，李祥瑞，等.九種中藥成分對(duì)新城疫Ⅳ系苗免疫雛雞血清中血凝抑制價(jià)的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35(4):468-472.

［10］GUO Z H，HU Y L，WANG D Y，et al.Sulfated modification can enhance the adjuvanticity of lentinan and improve the immune effect of ND vaccine［J］.Vaccine，2009，27:660-665.

［11］PINTO R A，ARREDONDO S M，BONO M R，et al.T Heper 1/T Helper 2 cytokine imbalance in respiratory syncytial virus infection as associated with increased endogenous plasma cortisol［J］.Pediatrics，2006，117:878-886.

［12］MA X，GUO Z H，SHEN Z Q，et al.The immune enhancement of propolis adjuvant on inactivated porcine parvovirus vaccine in guinea pig［J］.Cellular Immunology，2011，270:13-18.

［13］WANG D Y，LI X R，XU L X，et al.Immunologic synergism with IL-2 and effects of cCHMIs on mRNA expression of IL-2 and IFN-c in chicken peripheral T lymphocyte［J］.Vaccine，2006，24:7109-7114.

［14］CHEN Y K，WANG D Y，HU Y L，et al.Astragalus polysaccharide and oxymatrine can synergistically improve the immune efficacy of Newcastle disease vaccine in chicken［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2010，46:425-428.

［15］FAN Y P，HU Y L，WANG D Y，et al.Epimedium polysaccharide and propolis flavone can synergistically stimulate lymphocyte proliferation in vitro and enhance the immune responses to ND vaccine in chickens［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2010，47:87-92.