王繼春， 張傳健， 許夢微， 王志勝， 侯繼波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

鴨瘟病毒(Duck enteritis virus，DEV)屬于皰疹病毒目皰疹病毒科皰疹病毒甲亞科，是鴨病毒性腸炎(俗稱鴨瘟)的病原，能感染48種以上的雁形目水禽，如鴨、鵝和天鵝等［1-2］。鴨瘟呈急性發(fā)病，有高度的接觸傳染性，發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%，常表現(xiàn)為消化道黏膜糜爛、血管損傷引起的實質(zhì)性臟器出血及退性行變化、淋巴器官病變等［1，3-4］。

鴨瘟滅活疫苗和弱毒活疫苗均能對鴨瘟產(chǎn)生保護(hù)，其中弱毒活疫苗的免疫效果更佳，鴨瘟弱毒疫苗分為人工雞胚適應(yīng)毒和天然弱毒，免疫接種后1 d即可產(chǎn)生保護(hù)，免疫持續(xù)期可達(dá)1年以上［1，5-6］。疫苗株接種鴨只后不能排出足夠量的病毒，難于對同群鴨只產(chǎn)生有效感染，不能誘發(fā)接觸感染免疫。

鴨瘟病毒共有78個開放閱讀框。在建立感染性克隆的基礎(chǔ)上［7］，對鴨瘟病毒 2 085株進(jìn)行全基因測序，與GenBank中發(fā)表的強(qiáng)毒株和弱毒株序列對比發(fā)現(xiàn) UL47、UL41、UL12、UL2、US10 和 LORF11中的堿基缺失、移碼或非同義替代僅在弱毒株中出現(xiàn)，提示這6個開放閱讀框的變異可能與鴨瘟病毒的致病力變化高度相關(guān)［8］，而且這些變異不損傷鴨瘟病毒在雞胚上的增殖能力，但會有損于鴨瘟病毒在鴨只間的水平傳播能力。

2011年國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心從南京六合某鴨場的病死鴨中分離獲得一株鴨瘟病毒強(qiáng)毒株(LH2011株)，本研究對 LH2011株LORF11、UL47、UL41、UL12、UL2 和 US10 等位基因序列進(jìn)行測定，并結(jié)合GenBank中發(fā)表的其他鴨瘟強(qiáng)、弱毒株的序列，對其進(jìn)行進(jìn)一步對比分析，為深入研究鴨瘟病毒的機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鴨瘟病毒LH2011株由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心實驗室分離、鑒定和保存，對鴨的最小致死劑量為1 ml 1×10-5～1×10-7。SPF雞胚，購自中牧集團(tuán)南京藥械廠。Taq酶(Ex Tap酶)和PCR反應(yīng)試劑，購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物 根據(jù)已發(fā)表的鴨瘟病毒的LORF11、UL47、UL41、UL12、UL2 和 US10(JF999965;EU082088.2;JQ647509.1)開放閱讀框的上、下游序列中的保守序列分別設(shè)計1對引物(表1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers for PCR

1.2.2 模板DNA提取 病毒制備:取9～10日齡SPF雞胚，按常規(guī)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞，將DEV LH2011株按0.01的感染復(fù)數(shù)(MOI)接種雞胚成纖維細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)達(dá)60%～70%時，將上清液與細(xì)胞一起反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心15 min，取上清液備用。

病毒DNA的提取:①取制備的上清液445 μl，加入10%十二烷基磺酸鈉50 μl，20 mg/ml蛋白酶K 2.5 μl，混勻;置56 ℃ 水浴1 h，99 ℃ 水浴10 min，冷卻至室溫;②加入三羥甲基氨基甲烷飽和酚200.0 μl，混勻，4 ℃ 12 000 r/min，5 min，取上清液。重復(fù)2次;③加入三羥甲基氨基甲烷飽和酚100.0 μl和氯仿 100.0 μl，混勻，4 ℃ 12 000 r/min，5 min，取上清液;④加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉和1～2倍體積無水乙醇，上下顛倒混勻，置-20℃ 40 min至3～5 d;⑤4 ℃ 12 000 r/min，20 min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗滌，4℃ 12 000 r/min，1 min，棄上清液，洗滌 2次;⑥置超凈臺中風(fēng)干，加入 20.0～100.0 μl經(jīng)高壓滅菌的超純水溶解。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與序列測定 PCR反應(yīng)體系為:DNA 模板1.0 μl，Taq酶 (LORF11用Ex Taq酶)0.5 μl，上游引物 (10 pmol/μl)2.0 μl，下游引物 (10 pmol/μl)2.0 μl，dNTP 混合物 (dATP、dCTP、dGTP和 dTTP 濃度均為 2.5 mmol/L)4.0 μl，10 × Buffer 5.0 μl，Mg2+(25 mmol/L)4.0 μl，ddH2O 31.5 μl。樣品經(jīng)2 000 r/min離心瞬間混勻進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)程序為:94℃ 3 min預(yù)變性;94℃變性30 s，52℃退火40 s，72℃延伸(LORF11是3 min 40 s，UL47 是 2 min 30 s，UL41 是 1 min 30 s，UL12是2 min，UL2 是1 min，US10 是1 min)，循環(huán)40次，最后72℃延伸10 min，于4℃保存待檢。取5.0 μl PCR產(chǎn)物與Marker一起分別點(diǎn)入1%瓊脂糖凝膠上，電泳40 min，觀察擴(kuò)增片段的長度。將PCR反應(yīng)獲得的特異性片段的條帶切膠回收后由華大生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4 序列的對比分析 對測定的LORF11、UL47、UL41、UL12、UL2 和 US10 等位基因序列應(yīng)用VectorNTI(Invitrogen)進(jìn)行開放閱讀框(ORF)分析，并將其與GenBank上已發(fā)表的鴨瘟病毒的等位同源序列進(jìn)行對比分析，其中包括2085株(JF999965)、VAC株(EU082088.2)和CHv株(JQ647509.1)的所有這6個ORF序列，Holland株(JQ595417)、Jansen株(JQ430740.1)、D11-JW-016株(JQ430739.1)和clone-03株 (EU294364.1)的 LORF11，clone-03(EF492886.1)的 UL47，clone-03(EF524094.1)的UL12，Attenuated strain 2株(JQ347518.1)、Attenuated strain 1株 (JQ347517.1)、N3株(JQ248597.1)、LS株(JQ248598.1)、N2 株(JQ248596.1)、N1 株(JQ043216.1)和 clone-03株(EF449516.1)的 UL2，clone-03株(EF524095.1)的US10。

2 結(jié)果

2.1 LORF11同源子的典型特征

序列測定結(jié)果(圖 1A)顯示，LH2011的LORF11同源子長4 341 bp(JX885588)，與另一株分離自中國的強(qiáng)毒株CHv株的同源子閱讀框結(jié)構(gòu)一致，而與其他毒株的LORF11則表現(xiàn)出高度的變異性。與歐洲毒株(2085株、Jansen株、Holland株和D11-JW-016株)相比，一個1 071 bp的插入序列將 LH2011株的同源子分為了 2個 ORF，即LORF11A和 LORF11B，LORF11A的 ORF有235個氨基酸，其中氨基端164個與歐洲毒株同源，而LORF11B的ORF有923個氨基酸，其中羧基端892個氨基酸與歐洲毒株的羧基端氨基酸同源。與Clone-03株對比發(fā)現(xiàn)，后者LORF11中缺失了一個1 930 bp的堿基序列，LORF11A氨基端有211個氨基酸同源，LORF11B羧基端有592個氨基酸同源。VAC株雖然與Clone-03株相比又缺失了一個1 596 bp的序列，導(dǎo)致與LORF11B在羧基端僅有60個氨基酸序列同源。LORF11除了上述序列的插入或缺失外，各毒株之間還發(fā)生了許多非同義或同義替代，這些替代沒有明顯的規(guī)律可循(表2)。與CHv株相比，LH2011株的LORF11同源子在1 030位發(fā)生一個堿基缺失，但此區(qū)域并不在開放閱讀框LORF11A或LORF11B內(nèi)。

鴨瘟病毒的LORF11僅在禽皰疹病毒中有同源子，如馬立克氏病病毒、火雞皰疹病毒、傳染性喉氣管炎病毒等［9-11］，研究結(jié)果表明馬立克氏病病毒的LORF11與病毒的增殖與毒力相關(guān)［12］，其他病毒的LORF11功能未見報道。鴨瘟病毒LORF11的功能尚不清楚。從圖1A可以發(fā)現(xiàn)，與歐洲株不同的是中國強(qiáng)毒株和弱毒株均有一段142 bp的序列，提示這段序列可能與毒株的地域性相關(guān)，是中國源毒株的特異性序列。而與強(qiáng)毒株相比，無論Clone-03，還是VAC株均發(fā)生了大片段的序列缺失，提示這種變異很可能與病毒的毒力減弱相關(guān)，而Clone-03和VAC疫苗株仍能在雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞和鴨體生長，說明這些片段的缺失沒有對病毒的生長造成嚴(yán)重?fù)p害。

2.2 UL2序列分析

DEV的UL2是單純皰疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1，HSV-1)的UL2的同源基因，后者編碼尿嘧啶DNA糖基化酶，是一個非必須基因，是對病毒復(fù)制發(fā)揮重要作用的一種酶［13-14］。圖1顯示了LH2011株及幾種不同毒株的LORF11(A)和UL2(B)同源子序列的堿基插入或缺失。序列測定結(jié)果(圖1B)顯示，LH2011的UL2序列與2085株、N1株、N2株、N3株、LS株和CHv株鴨瘟強(qiáng)毒株完全一致(GenBank KC480259)，而與VAC株、Clone-03株、Attenuated strain 1株和Attenuated strain 2株鴨瘟弱毒株差異顯著。弱毒株均發(fā)生了一個528 bp的片段缺失，這段528 bp序列占UL2的一半以上，可能已導(dǎo)致UL2功能的喪失，提示這個片段缺失很可能與弱毒株的毒力減弱直接相關(guān)。圖1B中所注2085株和VAC株的起始位點(diǎn)是GenBank中登錄的序列標(biāo)注的位點(diǎn)，經(jīng)過進(jìn)一步分析其上游序列，發(fā)現(xiàn)與其他毒株一致，因此可以認(rèn)為這種起始位點(diǎn)的差異是由于預(yù)測軟件的不同導(dǎo)致的。從所有這些序列對比中發(fā)現(xiàn)，LH2011株的UL2與Attenuated strain 1株相比發(fā)生了1個非同義替代導(dǎo)致第2位氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楸彼?，與VAC株相比發(fā)生了1個非同義替代導(dǎo)致第24位氨基酸由谷氨酸變?yōu)槔i氨酸。此外，除VAC株外，所有毒株在下游280 bp序列中的3個堿基缺失使整個ORF發(fā)生移碼，導(dǎo)致了18個氨基酸的改變，因為這種改變在強(qiáng)毒株和弱毒株中均有出現(xiàn)，所以應(yīng)與病毒的毒力和生長能力無關(guān)。

圖1 LH2011株與不同鴨瘟病毒毒株的LORF11和UL2的對比Fig.1 Alignment of LORF11 homologues and UL2 between strain LH2011 and other DEV strains

2.3 LH2011株 UL47、UL41、UL12和 US10與歐洲強(qiáng)毒株2085株的比較

測序結(jié)果顯示，LH2011株的UL47、UL41、UL12和US10序列與2085株的序列完全相同(KC480260-KC480263)。UL47在HSV-1中的同源基因是一個非必須基因，在病毒囊膜中富聚，與UL6共同加強(qiáng)α-TIF活性［15］。對比UL47序列(表2)發(fā)現(xiàn)，在第36位氨基酸上，LH2011株、2085株和CHv株3個強(qiáng)毒株為丙氨酸，而VAC株和Clone-03株2個弱毒株為纈氨酸，提示這個變異可能與病毒毒力的變化相關(guān)。在113位、148位和598位(599位)上，LH2011株與2085株一致，而CHv株、VAC株、Clone-03株均相同。

UL41的單純皰疹病毒(HSV-1)同源基因是一個非必須基因，在病毒感染的早期發(fā)揮核糖核酸內(nèi)切酶的作用［16］。對比UL41的序列可以發(fā)現(xiàn)在第44位氨基酸上，包括LH2011的3個強(qiáng)毒株為谷氨酸，而2個弱毒株為甘氨酸，提示這個變異可能與病毒的毒力變化有關(guān)。在125位和301(302)位氨基酸位點(diǎn)上，LH2011株與2085株一致，而 CHv株、VAC株和 Clone-03株相同(表 2)。

表2 LORF11、UL47和UL41的單個氨基酸差異對比Table 2 Single amino acids in LORF11，UL47 and UL41 of different strains

UL12的HSV-1同源基因是一個非必須基因，編碼一種堿性核酸酶，參與病毒DNA復(fù)制［17］。LH2011株的UL12序列與CHv株和2085株一致，而與VAC株和Clone-03株2個弱毒疫苗株差別明顯，在VAC株中，因243位胸腺嘧啶發(fā)生缺失使得其ORF向下游移碼237 bp，造成氨基端丟失了79個氨基酸，被另2個氨基酸殘基取代。在Clone-03株中，因1324位插入一個胞嘧啶，使UL12的ORF提前終止，導(dǎo)致羧基端116個氨基酸被另5個非同義的氨基酸替代。此結(jié)果進(jìn)一步提示弱毒株中UL12編碼蛋白質(zhì)發(fā)生的變化可能與病毒的致病力減弱有關(guān)，而與病毒在雞胚成纖維細(xì)胞上的生長性能無關(guān)［8］。

US10的HSV-1同源基因是一個非必須基因，編碼一種囊膜磷蛋白質(zhì)，但其作用不明［18］。LH2011株的US10序列與2085株和CHv株完全一致，但2個弱毒株在787位都發(fā)生了一個胸腺嘧啶的缺失，導(dǎo)致ORF發(fā)生移碼，引起其下游35個氨基酸發(fā)生改變，而且整個ORF延長了11個氨基酸［8］。此差別發(fā)生在強(qiáng)、弱毒之間，提示這個變化可能與弱毒株的毒力減弱有關(guān)。

3 結(jié)論

LH2011 株的 ORF11、UL47、UL41、UL12、UL2 和US10表現(xiàn)出典型的強(qiáng)毒株的特征，其中LORF11、UL12、UL2和US10的變異僅在強(qiáng)毒株中被發(fā)現(xiàn)，且發(fā)生了大片段堿基序列的插入、缺失或移碼，提示可能與鴨瘟病毒的致病力相關(guān)，尤其是LORF11和UL2在強(qiáng)、弱毒株中差異更加顯著，應(yīng)是鴨瘟病毒機(jī)理研究的重點(diǎn)。鴨瘟病毒細(xì)菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome，BAC)技術(shù)的成功建立使得對病毒基因組進(jìn)行缺失、突變和插入的分子生物學(xué)操作可以利用大腸桿菌原核系統(tǒng)中的大量操作工具，能大大提高研究效率，且基因不易發(fā)生變異［7，19-21］，為開展鴨瘟病毒的機(jī)理研究和活載體疫苗的研制提供了強(qiáng)有力的研究工具，根據(jù)本研究的結(jié)果，可以首先對鴨瘟病毒的LORF11和UL2應(yīng)用BAC技術(shù)進(jìn)行基因敲除或插入，研究其在鴨瘟病毒致病力中的作用機(jī)理。

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