王 杰 ，余 瑜

（重慶醫(yī)科大學藥學院 400016）

多烯紫杉醇（docetaxe1）為一類半合成的紫杉醇類抗腫瘤藥，它作用于細胞微管蛋白，抑制細胞有絲分裂而發(fā)揮抗腫瘤作用，是現(xiàn)有藥物中治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌（MBC）和非小細胞肺癌（NSCLC）最有效的單劑化療藥物［1］。目前，有關多烯紫杉醇及其相關制劑在生物體內(nèi)的藥代動力學研究已經(jīng)在國內(nèi)外得到了較為廣泛的開展［2－5］。本實驗采用固相萃取法（SPE），選擇不同的固相填料，對多烯紫杉醇血漿樣品進行前處理研究，考察最適合的固相萃取條件。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；GL－88B型旋渦混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；PB602－E電子分析天平（瑞士梅特勒－托利多上海公司）；DCY－16S型氮吹儀（青島海科儀器有限公司）；TGL－16G臺式高速離心劑（上海安亭科學儀器廠）；Waters Oasis HLB柱（美國 Waters公司），Sep－pak vac c18小柱（美國Waters公司），Strata小柱（美國Phenomenex公司）。

多烯紫杉醇購自中國藥品生物制品檢定所（批號：10666－201002，純度大于或等于99.5%），紫杉醇購自中國藥品生物制品檢定所（批號：10382－200301，純度大于或等于99.5%），甲醇、乙腈為分析級色譜純（阿達瑪斯公司），實驗用水為高純水。

1.2 色譜條件 Phenomenex LUNA C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm，廣州菲羅門科學儀器有限公司）；流動相為甲醇－乙腈－水（42∶26∶32，v／v／v）；流速：1.0mL／min；檢測波長：230nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

1.3 固相萃取小柱洗脫條件考察

1.3.1 溶液的配制 分別取多烯紫杉醇對照品及內(nèi)標紫杉醇適量，精密稱定，用流動相稀釋成濃度均為0.1g／L的多烯紫杉醇對照液及紫杉醇內(nèi)標溶；空白人血漿稀釋成多烯紫杉醇和內(nèi)標紫杉醇濃度分別為0.05g／L和0.02g／L的樣品液；另外采用純甲醇和高純水分別配制成濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70% 、80%及 90% 的 甲 醇 溶 液 。

1.3.2 血漿樣品的固相萃取 將Waters Oasis HLB小柱用1 mL甲醇活化，1mL水平衡，加入1.3.1項下的樣品液1mL，用水分別預洗3次（A1～A3），每次1mL，棄去預洗液，再用1 mL乙腈洗脫（A4）；另取 Waters Oasis HLB小柱10支，分別用1mL甲醇活化，1mL水平衡，加入上述樣品液1mL，分別用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的甲醇各2mL進行洗脫（B1～B10），洗脫液用40℃氮氣吹干，1mL流動相重新溶解后0.45μm微孔濾膜過濾。分別取20μL按上述HPLC色譜條件進樣分析。

1.4 不同填料固相小柱的萃取效率 取1.3.1項制備的多烯紫杉醇對照品溶液和內(nèi)標溶液，用空白人血漿稀釋成多烯紫杉醇低、中、高濃度分別為0.1、1.0、10.0μg／mL的血漿樣品溶液（內(nèi)標紫杉醇濃度均為1μg／mL），每個濃度5份，用水稀釋1倍，作為樣品液。對 Waters Oasis HLB小柱，Waters Seppak vac C18小柱及Strata C18－E小柱進行比較。分別用1mL甲醇活化上述固相小柱，1mL水平衡，加入多烯紫杉醇血漿樣品液，分別用1mL水預洗3次，棄去預洗液，2mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40℃氮氣吹干，適量流動相重新溶解，0.45μm微孔濾膜過濾。取20μL按上述高效液相色譜法（HPLC）條件進行分析，得多烯紫杉醇與內(nèi)標紫杉醇峰面積比為A1。

另取1mL高純水代替人血漿配制低、中、高3個濃度為0.1、1.0、10.0μg／mL的多烯紫杉醇對照品溶液（內(nèi)標紫杉醇濃度均為1μg／mL），不經(jīng)萃取，按上述HPLC色譜條件進樣20μL分析，得多烯紫杉醇與內(nèi)標紫杉醇峰面積比為A2，按下式計算：回收率（%）＝（A1／A2）×100%。

2 結 果

2.1 血漿樣品固相萃取洗脫條件考察 采用 Waters Oasis HLB小柱為固相填料，以不同濃度的甲醇以及純乙腈作為洗脫劑時，結果見表1。從表1可知，采用Waters Oasis HLB小柱為固相填料，最大可用甲醇清洗的濃度為60%，而最小洗脫濃度為80%，乙腈的洗脫能力與甲醇相差不大?？紤]價格因素，故以純甲醇進行洗脫。

表1 多烯紫杉醇和內(nèi)標紫杉醇的清洗洗脫比較

圖1 空白血漿HPLC色譜圖

2.2 不同填料固相小柱的萃取效率 不同填料固相小柱對多西紫杉醇的萃取回收率見表2，HPLC色譜圖見圖1和圖2。由表2可知，當以Waters Oasis HLB小柱為固相填料進行多烯紫杉醇的血漿樣品萃取時，萃取回收率在95%～105%，RSD平均值為4.26%，適合用于血漿中多烯紫杉醇的測定。使用該小柱的回收率和精密度均高于另外2種固相小柱。

表2 不同填料固相小柱的萃取回收率（%，n＝5）

圖2 空白血漿加多烯紫杉醇和內(nèi)標HPLC色譜圖

3 討 論

血漿由于含有膽紅素而呈淡黃色液體，是血液的重要組成部分；血漿的化學成分中，水分占90%～92%，其他10%以溶質(zhì)血漿蛋白為主，并含有電解質(zhì)、營養(yǎng)素、酶類、激素類、膽固醇和其他重要組成部分。多烯紫杉醇為白色結晶性粉末，易溶于有機溶劑。多烯紫杉醇血漿樣品的前處理是體內(nèi)藥物分析工作的關鍵步驟，直接影響整個測定的準確性［6－7］。樣品預處理技術——固相萃取是由液固萃取和柱液相色譜技術相結合，主要用于樣品的分離、純化和濃縮；與液－液萃取法相比，可以更有效地分離分析物與干擾組分，減少樣品預處理過程，從而分析物的回收率［8－9］。固相萃取技術建立在液－固相色譜理論，采用選擇性吸附和洗脫的方式對樣品進行富集、分離和純化，利用選擇性吸附與洗脫的分離原理［10－11］。常用方法先讓液體樣品通過吸附劑（保留其中被測物質(zhì)），之后選用適當強度溶劑除去雜質(zhì)，最后用少量溶劑洗脫出被測物質(zhì)，達到快速分離凈化與濃縮的目的［12－13］。固相萃取作為樣品前處理技術，在實驗室中得到了越來越廣泛的應用［14－15］。

固相萃取主要分為3類：正相固相萃取、反相固相萃取和離子交換固相萃取。正相固相萃取所用的吸附劑都是極性的，主要取決于目標化合物的極性官能團與吸附劑表面的極性官能團之間相互作用，其中包括了氫鍵和π－π鍵的相互作用、偶極－偶極相互作用和偶極－誘導偶極相互作用以及其他的極性－極性作用；反相固相萃取所用的吸附劑和目標化合物通常是非極性的或極性較弱的，主要是靠范德華力或色散力（非極性－非極性相互作用）；離子交換固相萃取是靠目標化合物與吸附劑之間的相互作用是靜電吸引力。Waters Oasis HLB小柱的填料是由親脂性二乙烯苯和親水性N－乙烯基吡咯烷酮2種單體按一定比例聚合成而成，吸附容量高，批次間重現(xiàn)性好；美國Phenomenex公司的Strata C18－E小柱的填料是高度疏水的十八烷基鍵合硅膠基質(zhì)端基封尾鍵合相；美國waters sep－pak vac C18小柱的填料是十八烷基鍵合硅膠。HLB小柱的另一優(yōu)點是柱床干涸對提取影響不大，而另2種小柱在樣品上樣前，柱床不能干涸，否則需重新活化。

本研究表明，使用 Waters Oasis HLB小柱為固相填料進行多烯紫杉醇的血漿樣品萃取，比使用其他2種填料更加適合用于血漿中多烯紫杉醇的測定。

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