霍旺 楊明會(huì) 李紹旦 王朋

“脈絡(luò)—血管系統(tǒng)病”［1］理論認(rèn)為，脈絡(luò)與中小血管以及微循環(huán)具有密切相關(guān)性，孫絡(luò)作為脈絡(luò)分支的最末端結(jié)構(gòu)與微血管相對(duì)應(yīng)。孫絡(luò)系統(tǒng)功能正常對(duì)于保障機(jī)體微循環(huán)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，維持機(jī)體正常生理功能具有極其重要的意義?！皩O絡(luò)絀急”為孫絡(luò)一過(guò)性或持續(xù)性收縮、攣急狀態(tài)，是孫絡(luò)主要的病理變化之一，與微血管痙攣基本類(lèi)似［2］。當(dāng)前越來(lái)越多的研究證實(shí)，心之病絡(luò)“孫絡(luò)絀急”作為多種缺血性心臟病的共同病理基礎(chǔ)，參與著各種心系疾病的病理發(fā)展過(guò)程［3］。因此闡明“孫絡(luò)絀急”的微觀病理變化特征對(duì)于中醫(yī)理論指導(dǎo)臨床多種心系疾病的防治具有重要意義。本研究通過(guò)建立大鼠“孫絡(luò)絀急”模型，采用心肌組織HE染色、Nagar-Olsen特殊染色及透射電鏡等技術(shù)手段，從組織形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)等方面探討心之絡(luò)病“孫絡(luò)絀急”模型下心肌組織病理變化特征，為心之病絡(luò)中醫(yī)辨證論治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體重(220±20)g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK-(軍)2007-004。按6只/籠飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣籠具系統(tǒng)內(nèi)。溫度:(22±1)℃，濕度(50±5)%，每天光照與黑夜時(shí)間各12小時(shí)。實(shí)驗(yàn)期間造模、取材等操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，添加飼料、換水等由專(zhuān)人負(fù)責(zé)管理。

1.2 主要藥物與試劑

垂體后葉素(pituitrin，pit)注射液(南京新百藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):111204);烏拉坦(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):T20111110);4%多聚甲醛(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào):AR-0211);50%戊二醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20111215)。

1.3 主要儀器

動(dòng)物心電圖機(jī)(FX-211，北京福田電子醫(yī)療儀器);光學(xué)顯微鏡(CH-2，日本Olympus公司);多功能顯微鏡帶相機(jī)(FDX-35，日本Nikon公司 );透射電子顯微鏡(H-7650，日本日立公司);超薄切片機(jī)(UCT，德國(guó)萊卡公司)。

1.4 造模及分組處理

“孫絡(luò)絀急”大鼠模型參照文獻(xiàn)予股靜脈注射pit方法進(jìn)行復(fù)制［4］，心電圖標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高＞0.1 mV說(shuō)明造模成功。30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成正常組和造模5分鐘組、10分鐘組、20分鐘組、30分鐘組5組，每組各6只。各組大鼠20%烏拉坦按5 ml/kg劑量腹腔注射麻醉，麻醉后仰位固定于鼠臺(tái)，由四肢皮下插入電極針連接動(dòng)物心電圖機(jī)。大鼠腹股溝處常規(guī)消毒，鈍性分離股靜脈，各模型組股靜脈注射pit 6 U/kg(5秒內(nèi)勻速注射完畢)，正常組注射等量生理鹽水。

1.5 標(biāo)本處理與觀察

1.5.1 HE染色 各組大鼠摘取心臟，冰浴下取左心室前壁心尖組織，至于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制備石蠟切片，超薄切片機(jī)切片，切片厚度5μm。形常規(guī)HE染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蘇木素液染色，1%鹽酸乙醇分化，反藍(lán)，乙醇伊紅染色，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)并拍照。

1.5.2 Naga-Olsen染色 心肌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蘇木精染色1分鐘，清水洗滌，蒸餾水漂洗，堿性復(fù)紅液染色3分鐘，丙酮苦味酸溶液分化，丙酮脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀察［5］。

1.5.3 電鏡 各組大鼠冰浴下取左室心尖部心肌組織各2塊，每塊體積1 mm ×1 mm ×2 mm，將組織塊固定于2.5%戊二醛中2小時(shí)，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗后，1%鋨酸后固定1小時(shí)，經(jīng)丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片機(jī)切片，片厚約70 nm，先后經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

光學(xué)顯微鏡下顯示，各模型組心肌細(xì)胞胞質(zhì)、胞核顯示清楚，細(xì)胞膜完整界限清楚，心肌肌原纖維可見(jiàn)，未見(jiàn)變性和壞死。心肌細(xì)胞間毛細(xì)血管管腔內(nèi)有紅細(xì)胞，心內(nèi)膜平滑。未見(jiàn)炎性細(xì)胞。各組間心肌均未見(jiàn)明顯缺血性病理改變，見(jiàn)圖1。

2.2 Naga-Olsen染色

切片經(jīng)Nagar-Olsen染色后，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)正常心肌組織染成黃色，而缺血心肌組織可見(jiàn)紅染的陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)。與正常組比較，各模型組均可見(jiàn)到大片紅染的陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)域，且尤以10、20分鐘時(shí)陽(yáng)性反應(yīng)最為明顯，見(jiàn)圖2。

2.3 電子顯微鏡

透射電子顯微鏡下，正常組線粒體膜完整，形態(tài)規(guī)則，線粒體嵴豐富，排列整齊;模型5分鐘組線粒體明顯腫脹，線粒體嵴稀疏并有少量空泡性變;模型10分鐘組線粒體嵴排列紊亂、斷裂消失甚至呈空泡性變;模型20分鐘組及30分鐘組可見(jiàn)大部分線粒體嵴斷裂消失呈空泡性變，見(jiàn)圖3。正常組心肌細(xì)胞可見(jiàn)核膜完整，染色質(zhì)分布均勻，各模型組電鏡下可見(jiàn)心肌細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)邊集，心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯，見(jiàn)圖4。正常組微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核膜完整，染色質(zhì)分布均勻。各模型組微血管內(nèi)皮細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)不均勻、邊集，凋亡現(xiàn)象明顯，吞飲小泡數(shù)量顯著增加，見(jiàn)圖5。

3 討論

“孫絡(luò)絀急”是在絡(luò)病學(xué)理論基礎(chǔ)上提出的新概念?！敖I”有屈曲緊急之意，“急”即拘急，“絀急”則意為屈曲拘急，有痙攣之意［6］。既往研究基于血脈與血管在解剖形態(tài)學(xué)上的同一性，提出了“脈絡(luò)—血管系統(tǒng)病”［1］理論，微血管屬于血脈分支脈絡(luò)末端之孫絡(luò)，從血脈分之而出逐層細(xì)分遍布全身的“孫絡(luò)—微血管”發(fā)揮著滲灌氣血、濡養(yǎng)代謝、津血互換的生理功能。因此微血管病變導(dǎo)致器官組織功能、結(jié)構(gòu)的病理改變與孫絡(luò)受損進(jìn)而導(dǎo)致孫絡(luò)病的病理變化具有密切相關(guān)性?！懊}絡(luò)—血管系統(tǒng)病”和“絡(luò)病學(xué)說(shuō)”的提出為微血管病變的中醫(yī)辨證論治提供了理論依據(jù)。有學(xué)者在既往研究中通過(guò)對(duì)“絡(luò)脈絀急”相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提出了中醫(yī)絡(luò)脈絀急與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)冠狀動(dòng)脈痙攣、血管內(nèi)皮功能紊亂之間的密切相關(guān)性［7］，這一理論對(duì)于指導(dǎo)冠狀動(dòng)脈微血管痙攣的中醫(yī)辨證研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本研究采用股靜脈注射垂體后葉素方法建立心之絡(luò)病“孫絡(luò)絀急”大鼠模型，并通過(guò)觀察心肌組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化，以探討心之絡(luò)病“孫絡(luò)絀急”模型下心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化特征。本研究結(jié)果顯示，各模型組心肌組織HE染色并未見(jiàn)因絀急導(dǎo)致的明顯病理改變，而采用Nagar-Olsen特殊染色處理后在各模型組則均可見(jiàn)到大片陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)，提示“孫絡(luò)絀急”在較短時(shí)間內(nèi)即可引起心肌組織明顯缺血，并且其缺血程度尤以造模10分鐘、20分鐘組最為明顯。兩種染色方法結(jié)果的差異性究其原因主要與其染色原理有關(guān)，HE染色主要基于細(xì)胞內(nèi)酸堿關(guān)系的明顯變化或細(xì)胞內(nèi)壞死物質(zhì)的積聚，而這些病理改變一般發(fā)生在細(xì)胞死亡后的6至12小時(shí)［8］，因此在短時(shí)間內(nèi)并不能看到明顯病理改變。而Nagar-Olsen特殊染色主要基于心肌早期缺血改變與正常心肌對(duì)某些色素的著色性質(zhì)不同而呈現(xiàn)不同的色調(diào)，因而可以顯示和判定心肌早期缺血的變化［9］。此結(jié)果提示，與HE染色相比Nagar-Olsen特殊染色對(duì)早期心肌缺血更為敏感，可作為早期心肌缺血損傷的檢測(cè)手段。

心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變是反映細(xì)胞損傷最直觀的指標(biāo)。線粒體是維持細(xì)胞能量的功能單位，對(duì)缺血缺氧最為敏感，是反應(yīng)心肌細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)［9］。本研究結(jié)果顯示，投射電鏡下各模型組可見(jiàn)線粒體嵴明顯稀疏、模糊斷裂，甚至出現(xiàn)空泡性變，并且各模型組心肌細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)邊集，心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯，此結(jié)果提示“孫絡(luò)絀急”導(dǎo)致的缺血缺氧在較短時(shí)間內(nèi)即可引起心肌細(xì)胞明顯受損。生理狀態(tài)下，微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于維持血液正常流態(tài)、調(diào)節(jié)微血管張力以及血管內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換等方面具有極其重要意義［11］，其結(jié)構(gòu)的完整性是生理功能得以發(fā)揮的重要基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，各模型組均可見(jiàn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)不均勻、邊集，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，凋亡現(xiàn)象明顯。提示“孫絡(luò)絀急”可加劇微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，引起微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致其正常生理功能發(fā)生紊亂。此外，各模型組微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞飲小泡數(shù)量顯著增加，亦提示“孫絡(luò)絀急”模型下微血管內(nèi)皮細(xì)胞可能通過(guò)增加吞飲小泡數(shù)量的方式引起微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變，從而發(fā)揮相應(yīng)的病理生理作用。

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