李堰忠，楊旭中，呂 強(qiáng)，王富軍，趙 健*

(1.華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實驗室，上海 200237;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

許多藥物蛋白需要在細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮作用。然而細(xì)胞膜作為細(xì)胞的天然屏障，使其無法進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)[1]，主要原因是活性分子的親水特性[2]，因此成為一些蛋白藥物開發(fā)的瓶頸。

細(xì)胞穿膜肽(cell－penetrating peptides，CPPs)是一些小于30個氨基酸[3]的短肽，能夠攜帶分子量比自身大許多倍的分子進(jìn)入細(xì)胞[4]，這一特性依賴于其自身所帶正電荷和特殊的二級結(jié)構(gòu)[5]。Green和Frankel[6－7]首次觀察到來自HIV－1反式激活因子的TAT序列可以被不同類型的細(xì)胞高效吸收。但由于來源于病毒的TAT在臨床因安全性方面存在風(fēng)險，人源性的穿膜肽正不斷受到人們的關(guān)注。

p14ARF是一種人腫瘤抑制因子，在正常細(xì)胞中參與細(xì)胞周期的調(diào)控。研究人員發(fā)現(xiàn)化學(xué)法合成的p14ARF N端22個氨基酸(MVRRFLVTLRIRRACGPPRV RV－NH2)，即ARF，具有攜帶大分子穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的功能，其穿膜效率具有濃度和時間依賴性，并且ARF還能進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)[3]。但化學(xué)法合成ARF用于攜載藥物蛋白成本高，本文根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性，設(shè)計合成ARF核酸序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒，以綠色熒光蛋白EGFP作為攜載分子與ARF進(jìn)行融合表達(dá)，觀察ARF在HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。

在融合蛋白構(gòu)建中，為了保證融合蛋白中各蛋白的活性，融合蛋白之間通常需要加入特定的短肽，稱為Linker[8]，從空間上分隔融合的兩個蛋白分子折疊時的互相干擾，保持各自的功能[9]。連接肽序列(linker peptide)的選擇與設(shè)計是構(gòu)建融合蛋白的關(guān)鍵[10]，包括連接肽的長度、結(jié)構(gòu)的剛性和柔性以及連接肽電荷性質(zhì)等[11]。鞠武建等[12]在重組蛋白中引入連接肽后，蛋白活力提高四倍。Ryoichi等[13]研究了不同形式的連接肽，結(jié)果表明剛性連接肽和柔性連接肽能保證融合蛋白正確折疊，發(fā)揮作用，甚至增強(qiáng)其功能。另有報道[8]認(rèn)為連接肽長度過長時，融合蛋白穩(wěn)定性下降，并對蛋白酶敏感，表達(dá)時易被降解，導(dǎo)致活性蛋白產(chǎn)量下降。本實驗嘗試在ARF與EGFP融合蛋白之間引入不同長度(linker2、linker7)和不同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)如柔性(flexible linker)或剛性 (stable linker)的連接肽，研究其對融合蛋白功能的影響，并觀察各種連接肽對ARF攜載EGFP穿膜活性的影響，為ARF攜帶藥物蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)有效發(fā)揮藥理作用進(jìn)行探索研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 文中所使用的大腸桿菌JM83由葉江老師惠贈;HeLa細(xì)胞、大腸桿菌BL21(DE3)為本實驗室保存;表達(dá)載體pET28a－EGFP由本實驗室構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)和表達(dá)純化 大腸桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基;誘導(dǎo)劑為異丙基硫代－β－D－半乳糖苷(IPTG)終濃度為50 μg/mL;表達(dá)重組質(zhì)粒時添加卡那霉素，終濃度為50 μg/mL;15℃下誘導(dǎo)12～16 h;超聲破碎菌體，Ni－NTA柱純化目的蛋白。

1.1.3 試劑 限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA Marker、蛋白Marker購自TAKARA;IPTG購自上海生工;質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購自Biomiga公司。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)操作 酶切和連接、大腸桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化、SDS－PAGE電泳等技術(shù)參見《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》等。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a－EGFP－linker2－ARF的構(gòu)建 依據(jù)文獻(xiàn)所報道的ARF氨基酸序列(VRVRPPGCARRIRLTVLFRRVM)和大腸桿菌密碼子偏愛性，設(shè)計并由上海捷瑞生物工程有限公司合成ARF正反義鏈，引入酶切點(diǎn)BamH I和Xho I(下劃線)。

正義鏈:

反義鏈:

將合成的ARF核酸序列溶解、混合，100℃沸水浴變性10 min，室溫下復(fù)性，用T4 ligase與BamH I/Xho I聯(lián)合酶切的pET28a－EGFP(本實驗保存)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM83，鑒定并測序。重組質(zhì)粒命名為 pET28a－EGFP－linker2－ARF。

1.2.3 pET28a－EGFP－linker7S－ARF、pET28a－EGFP－linker7F－ARF 融合質(zhì)粒構(gòu)建 以 EGFP 基因為模板，在其3'端分別引入柔性7肽(GGGGSGS)和剛性7肽(EAAAKGS)，并引入酶切位點(diǎn)Nde I和BamH I，引物見表 1。

表1 擴(kuò)增7個氨基酸柔性和剛性連接肽的PCR引物Tab.1 The PCR primers for stable and flexible linker peptide of 7 amino acids

PCR反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性50 s，退火溫度0.5 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次;72℃延伸10 min，4℃保溫。電泳并回收目的條帶，連接至pMD19－T simple vector后測序。測序正確后以Nde I/BamH I聯(lián)合酶切并回收目的片段，并與相同內(nèi)切酶處理的pET28a－EGFP－linker2－ARF載體連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒，分別命名為 pET28a－EGFP－linker 7F－ARF、pET28a－EGFP－linker 7S－ARF(圖1)。

圖1 pET28a－EGFP－linker 7S－ARF、pET28a－EGFP－linker 7F－ARF 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmids of pET28a－EGFP－linker 7S－ARF、pET28a－EGFP－linker 7F－ARF

1.2.4 融合蛋白在E.coli中的表達(dá)與純化 將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，挑取LB固體培養(yǎng)基上單菌落，接種于30 mL含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8～12 h;將此培養(yǎng)物以1%的接種量接種至200 mL含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液OD600為0.8～1.0后，加入IPTG，終濃度為50 μg/mL，15℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜。將過夜表達(dá)的菌液離心收集，用緩沖液(20 mmol/L Tris－HCl，0.5 mmol/L NaCl，5%甘油，pH 8.5)重懸，超聲破碎并離心，收集上清。

利用融合蛋白N端6×His標(biāo)簽，由Ni－NTA柱純化富集(填料型號:Ni－NTA Agarose Cat#R901－15，Invitrogen)。用20 mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH8.5)平衡 Ni－NTA 柱后，將上述上清過柱。20 mmol/L Tris－HCl緩沖液洗滌，共5倍柱體積。200 mmol/L咪唑洗脫得到目的蛋白。收集目的蛋白，用梯度濃度NaCl透析液透析蛋白，13.5%SDS－PAGE電泳鑒定蛋白純度。

1.2.5 融合蛋白熒光強(qiáng)度檢測 Bradford法測定3個蛋白濃度，用緩沖液(20 mmol/L Tris－HCl，pH7.2)稀釋至10 μg/mL。各取100 μL加至黑色96孔板內(nèi)，利用熒光酶標(biāo)儀分析三者的熒光強(qiáng)度。1.2.6 激光共聚焦檢測 將HeLa細(xì)胞以5×104/孔接于放有玻片的24孔板中，于37℃培養(yǎng)約8 h，至其貼壁后加入100 μg/mL樣品孵育10 h，用0.4%多聚甲醛固定后DAPI染色，激光共聚焦觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGFP－linker2－ARF 融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)和純化

按照材料與方法1.2.2構(gòu)建 pET28a－EGFP－linker2－ARF，測序表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。將其轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、純化，得到融合蛋白EGFP －linker2－ ARF，SDS－PAGE 電泳結(jié)果顯示融合蛋白分子量約為30 ku(圖2)，與預(yù)期相符，說明融合蛋白成功進(jìn)行了表達(dá)。

但EGFP－linker2－ARF融合蛋白熒光強(qiáng)度非常弱(圖3)，推測由于linker2過短，導(dǎo)致ARF嚴(yán)重干擾了EGFP的折疊，因此影響融合了EGFP功能的發(fā)揮。

圖2 重組蛋白EGFP－linker2－ARF的SDS－PAGE檢測Fig.2 SDS－PAGE detection of expressed recombinant protein EGFP－linker2－ARF

2.2 EGFP－linker7 F/S－ARF 融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

為了避免ARF對EGFP折疊的影響，進(jìn)一步將連接肽優(yōu)化為linker 7S和linker 7F。按照方法1.2.3，以設(shè)計的 linker7引物進(jìn)行 PCR(表1)擴(kuò)增得到大小為759 bp的片段，如圖4(a)，酶切后將其與相同內(nèi)切酶處理的pET28a－EGFP－linker2－ARF表達(dá)質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a－EGFP－linker 7S－ARF 和 pET28a－EGFP－linker 7F－ARF，由雙酶切鑒定，插入片段大小正確，如圖4(b)，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖3 融合蛋白熒光強(qiáng)度比較Fig.3 Comparison of fluorescence intensity between 3 recombinant proteins

圖4 EGFP－linker 7S和EGFP－linker 7F核酸片段的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.4 Amplification of EGFP－linker 7S and EGFP－linker 7F fragments and identification of recombinant plasmids by double digestion

2.3 EGFP－linker 7S－ARF、EGFP－linker 7F－ARF 在 E.coli中的表達(dá)與純化

按照1.2.4 節(jié)所述，將構(gòu)建成功的表達(dá)質(zhì)粒 pET28a－EGFP－linker 7S－ARF 和 pET28a－EGFP－linker 7F－ARF在宿主菌E.coli中表達(dá)，其表達(dá)純化圖譜分別如圖5(a)、5(b)所示。融合蛋白分子量大小約為30 ku，與預(yù)測相符。經(jīng)Ni－NTA親和層析柱一步純化后，分別得到目的蛋白EGFP－linker 7S－ARF(圖5a，lane7)和 EGFP－linker 7F－ARF(圖 5b，lane7)，電泳條帶顯示目的蛋白可能有降解，因此進(jìn)行Western blot檢驗。圖5(b)－8為EGFP－linker 7F－ARF融合蛋白的Western雜交結(jié)果，說明純化的樣品確有部分降解。

圖5 融合蛋白的SDS－PAGE和western blot檢測Fig.5 SDS－PAGE and western blot detection of expressed recombinant protein

圖6 激光共聚焦顯微鏡檢測融合蛋白對HeLa細(xì)胞的穿膜活性(60×)Fig.6 The uptake efficiency of fusion proteins by HeLa via laser confocal microscope(60×)

2.4 不同linker的融合蛋白熒光強(qiáng)度檢測

利用熒光酶標(biāo)儀，在相同蛋白濃度下(10 μg/mL)，對 EGFP－ARF 各種不同連接肽的融合蛋白進(jìn)行熒光檢測，測定3種蛋白熒光強(qiáng)度(圖3)。結(jié)果表明，EGFP－linker 7S－ARF和EGFP－linker 7F－ARF熒光強(qiáng)度分別 EGFP－linker 2－ARF高 2.5倍和2.9倍。說明引入linker 7后，融合蛋白熒光強(qiáng)度增加，即增加連接肽長度有利于綠色熒光蛋白的正確折疊。

2.5 融合蛋白 EGFP－linker 7－ARF的穿膜活性檢測

由于linker7連接肽的引入使融合蛋白的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，進(jìn)一步利用激光共聚焦技術(shù)對EGFP－linker7－ARF的穿膜活性進(jìn)行觀察。以EGFP－linker 2－ARF為對照，發(fā)現(xiàn)不同連接肽對融合蛋白細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性有顯著影響，結(jié)果見圖6。胞內(nèi)熒光強(qiáng)度定量分析表明，EGFP－linker 7F－ARF胞內(nèi)熒光強(qiáng)度與 EGFP－linker2－ARF和 EGFP－linker 7S－ARF相比有明顯增強(qiáng)，分別提高了4.9倍和3.8倍 (圖7)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)融合蛋白EGFP－linker 7F－ARF在HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞核和胞質(zhì)中均有分布(圖6K)。

圖7 3種不同連接肽的融合蛋白胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度比較Fig.7 Comparison of average fluorescence intensity of recombinant proteins with three different linker peptides in cells

3 討論

真核細(xì)胞及其細(xì)胞器的膜對親水性活性分子和藥物到達(dá)靶點(diǎn)發(fā)揮功能形成障礙。許多技術(shù)被用于提高外源分子進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)化效率，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等，但效率都較低。細(xì)胞穿膜肽(cell－penetrating peptide)作為一種新型的藥物運(yùn)輸工具，由于其轉(zhuǎn)導(dǎo)活性高，目前已經(jīng)引起研究者的廣泛關(guān)注[4]。

ARF是由Henrik等[3]發(fā)現(xiàn)的一種人源性穿膜肽，研究人員通過其多肽直接合成的方法進(jìn)行了ARF穿膜活性研究，但化學(xué)合成的方法成本高，且無法判斷其對蛋白藥物的運(yùn)輸能力。本課題組以EGFP為攜載蛋白，利用融合蛋白表達(dá)技術(shù)，表達(dá)并純化了融合蛋白EGFP－ARF，觀察它對HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。

實驗設(shè)計中首先在融合蛋白EGFP－ARF中引入2個氨基酸的連接肽，稱為EGFP－linker2－ARF，但重組蛋白熒光強(qiáng)度非常弱。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[11]，適宜的連接肽長度對融合蛋白的功能至關(guān)重要，推測是由于連接肽過短，導(dǎo)致EGFP蛋白功能受到影響。隨后在EGFP和ARF之間引入7個氨基酸長度的連接肽，并且分別以剛性和柔性的方式進(jìn)行連接，稱為融合蛋白EGFP－linker 7S－ARF(剛性連接)和EGFP－linker 7F－ARF(柔性連接)，并成功地進(jìn)行了融合蛋白的表達(dá)和純化，Western blot結(jié)果顯示，與linker2相比，較長的連接肽可能會導(dǎo)致目的蛋白稍有降解，后續(xù)研究中可以考慮將His標(biāo)簽置于融合蛋白C端，可以避免重組蛋白表達(dá)和純化過程中的降解。熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果顯示EGFP－linker 7－ARF的熒光強(qiáng)度比EGFP－linker 2－ARF的高，表明增加連接肽長度，可以明顯提高EGFP的生物活性。進(jìn)一步通過激光共聚焦技術(shù)觀察3種不同連接肽的融合蛋白對HeLa細(xì)胞的穿膜活性，結(jié)果顯示EGFP－linker 7F－ARF和EGFP－linker 7S－ARF的胞內(nèi)熒光強(qiáng)度與EGFP－linker 2－ARF相比都有提高，其中l(wèi)inker 7S連接方式提高最明顯，為linker 2的5倍左右。說明柔性連接肽對EGFP正確結(jié)構(gòu)的折疊和ARF空間結(jié)構(gòu)影響都比較小，因此保持了EGFP－linker 7F－ARF對HeLa細(xì)胞較高的穿膜活性。

人源性穿膜肽以其出色的攜載能力、穿膜能力和安全性，已經(jīng)成為腫瘤藥物開發(fā)的熱點(diǎn);然而連接肽的選擇是融合蛋白技術(shù)中的關(guān)鍵步驟，本實驗比較了連接肽長度和性質(zhì)，實驗結(jié)果顯示ARF和EGFP之間引入7個柔性連接的氨基酸連接肽的融合蛋白EGFP－linker 7F－ARF穿膜活性最佳。本課題為人源性穿膜肽ARF連接肽的選擇及其作為藥物運(yùn)輸載體的研究提供了借鑒。

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