孫永剛，譚緒云，楊小毛，杜選峰，王 輝，馬占元，袁 利，曾青華，徐 倩，趙 倩，鄭 倩

解放軍第535醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖南懷化 418000

食管癌是我國高發(fā)惡性腫瘤之一，死亡率非常高[1-2]。原癌基因Bmi-1屬于polycomb家族，直接參與細(xì)胞生長增殖的調(diào)節(jié)。研究表明，Bmi-1基因的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-6]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法和熒光定量PCR檢測Bmi-1在48例食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，探討B(tài)mi-1與食管鱗癌生物學(xué)行為的關(guān)系。

材料和方法

1 材料 本研究病理資料取自我院2008-2010年間住院手術(shù)的食管鱗癌患者，每例手術(shù)標(biāo)本分別在食管鱗癌組織及對應(yīng)癌旁5 cm組織取材，全部病例術(shù)前均未做化療、放療；其中男30例，女18例，年齡40~70(平均65.3)歲。所有病例均經(jīng)病理確診。SP試劑盒由福州邁新公司提供，兔抗人Bmi-1單克隆抗體由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

2 免疫組織化學(xué)染色 標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片厚3~4μm，免疫組化染色。免疫組化采用EnVision二步法，微波爐抗原修復(fù)，Bmi-1工作稀釋度為1∶200，以公司提供的陽性片染色作為陽性對照，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素襯染后，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。結(jié)果判斷：Bmi-1免疫組化染色陽性信號在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀沉淀。陽性細(xì)胞超過腫瘤細(xì)胞數(shù)的10%定義為陽性，否則為陰性。結(jié)合臨床資料，統(tǒng)計48例食管鱗癌患者癌組織Bmi-1表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征的關(guān)系。

3 Real time PCR分析 按Trizol試劑盒提供的操作步驟提取10例正常食管組織和20例食管癌組織標(biāo)本的總RNA。利用Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)Real time PCR試劑盒(TAKARA公司)與擴(kuò)增儀(ABI5700型)說明，采用50μl反應(yīng)體系(2×SYBR Premix Ex TaqTM 25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，50×ROX Reference Dye 1μl，cDNA 溶液 4μl，DEPC H2O 18μl) 95℃ 預(yù) 變 性 180s；95℃ 20s，60℃ 60s，40個循環(huán)，利用比較CT法檢測樣本的mRNA表達(dá)情況。以正常食管黏膜為校正樣本，其mRNA值設(shè)置為1，反應(yīng)體系以甘油醛232磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照，Bmi-1引物序列為：上游引物5'-TCATCCTTCTGCTGATGCTG-3'，下游引物5'-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3' GAPDH引物序列為：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。引物序列見文獻(xiàn)[7]。

4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件分析，食管鱗癌臨床病理參數(shù)與Bmi-1蛋白表達(dá)率之間的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 食管癌組織中Bmi-1的表達(dá)增高 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在食管鱗癌中Bmi-1蛋白呈高表達(dá)，癌旁組織中無表達(dá)或低表達(dá)(見圖1)。食管鱗癌組織中Bmi-1陽性率為83.3%(40/48)，癌旁組織Bmi-18例表達(dá)，陽性率為16.6%(8/48)(P＜0.001)。Real time PCR進(jìn)一步證實，食管癌組織中Bmi-1的mRNA表達(dá)顯著高于其癌旁組織，與蛋白表達(dá)一致(見圖2)。

2 Bmi-1蛋白的表達(dá)及與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Bmi-1高表達(dá)與組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)(P＞0.05)。見表1。

表1 食管鱗癌組織中Bmi-1蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系Tab 1 Relation between Bmi-1 protein expression and clinical characteristics of ESCC(n, %)

圖1 Bmi-1蛋白在食管鱗癌組織中的免疫組織化學(xué)染色(×200)Fig.1 Immunohistochemixal staining showing Bmi-1 protein expression in ESCC tissues(×200)

圖2 Real time PCR檢測結(jié)果 1：食管癌組織；2：癌旁組織aP＜0.05，與食管癌組織比較Fig.2 RT-PCR showing Bmi-1mRNA in ESCC tissue and its adjacent tissue 1: esophageal squamous cell carcinoma tissues; 2: adjacent esophageal mucosa aP＜0.05, vs ESCC tissues

討 論

人類Bmi-1基因位于第10號染色體短臂1區(qū)3帶(10p13)，由十個外顯子組成，cDNA全長3 251 bp，其開放閱讀框編碼的蛋白含有326個氨基酸，相對分子質(zhì)量為44 000-46 000。Bmi-1是公認(rèn)的一種原癌基因，它可協(xié)同c-myc共同作用，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[8]。

大量研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，黃小杏[9]等運(yùn)用免疫組化方法檢測了Bmi-1在卵巢癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Bmi-1在卵巢癌高表達(dá)，而在正常卵巢組織中無表達(dá)，Kaplan-Meier生存分析顯示Bmi-1蛋白高表達(dá)卵巢癌患者生存時間明顯低于低表達(dá)組，Kim等[10]檢測了大腸癌及癌旁正常組織中Bmi-1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大腸癌中Bmi-1 mRNA的表達(dá)較正常組織高2-3倍，且同時伴有p16蛋白的低表達(dá)，并認(rèn)為Bmi-1基因通過抑制p16蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)48例食管鱗癌組織中有40例陽性表達(dá)，陽性率為83.3%；而癌旁組織中僅8例表達(dá)，陽性率為16.6%，Bmi-1陽性表達(dá)率與食管鱗癌患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)(P＞0.05)；與組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，這表明Bmi-1參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程。

本文從蛋白和基因轉(zhuǎn)錄水平研究了Bmi-1基因表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果表明Bmi-1基因在食管癌發(fā)生及預(yù)后過程中起重要作用，也為進(jìn)一步闡明食管癌發(fā)生的分子機(jī)制提供了實驗依據(jù)。同時檢測Bmi-1對食管癌的早期診斷、治療及預(yù)后判斷有重要指導(dǎo)意義。

1 Zhang N，Yu C，Wen D，et al. Association of Nitrogen compounds in drinking water with incidence of esophageal squamous cell carcinoma in Shexian，China［J］. Tohoku J Exp Med，2012，226（1）：11-17.

2 劉天星，景麗，呂星晨，等．52例食管癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)三維適形放射治療分析［J］．軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報，2011，32（11）：1115-1116．

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10 Kim JH，Yoon SY，Kim CN，et al. The Bmi-1 oncoprotein is overexpressed in human colorectal Cancer and correlates with the reduced p16INK4a/p14ARF proteins［J］. Cancer Lett，2004，203（2）：217-224.