忻 雅，阮松林，馬華升，王淑珍，方獻平，肖文斐，吳根良

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

草莓有“水果皇后”之美譽，不僅有獨特的口味還有較高的營養(yǎng)價值。我國是草莓的主要生產(chǎn)國，種植面積和產(chǎn)量位居世界前列。隨著社會的進步、技術(shù)的發(fā)展，僅依靠簡單遺傳模式的傳統(tǒng)草莓育種技術(shù)已不能完全滿足市場對草莓色、香、味、營養(yǎng)、安全等方面的要求，而這一需求可能隨著分子生物學(xué)在動植物新品種選育及改良上的廣泛應(yīng)用逐漸得到解決。但栽培草莓(鳳梨草莓，F(xiàn)ragaria ananassa Duch.)為高度雜合的八倍體，與其它園藝植物如番茄、葡萄、柑橘相比，草莓基因組學(xué)和生理生化方面的研究極其缺乏，極少數(shù)報道提供了部分基因序列，但沒有揭示關(guān)鍵過程的分子機制，所以有關(guān)草莓分子生物學(xué)方面的研究遠遠不能滿足其育種需求[1]。

目前，我國生產(chǎn)上主栽品種多引自國外，近年來隨著栽培品種數(shù)量增加、不同地區(qū)之間頻繁引種以及草莓本身的營養(yǎng)繁殖特性，使得品種名稱十分混亂。這對草莓栽培品種的鑒定提出了更高要求，以前主要是利用形態(tài)標記鑒定草莓品種，而20世紀90年代發(fā)展起來的分子標記比形態(tài)標記具有多方面的優(yōu)越性。日本有通過DNA鑒定技術(shù)保護本國草莓的方法[2]，其他國家較多的運用RAPD標記進行草莓品種鑒定[3-5]，國內(nèi)最近的報道是用AFLP標記進行草莓品種的遺傳關(guān)系分析[6]，利用GISH和RAPD進行種間雜種的檢測[7]，利用RAPD和SCAR標記對32份草莓材料進行鑒定[8]。但研究表明RAPD標記對實驗條件敏感，可重復(fù)性較差，為此，國外已開始把穩(wěn)定高效的SSR標記應(yīng)用于草莓品種鑒定[9-10]，而國內(nèi)鮮有這方面的報道。本文利用已有的各種分子標記對南方現(xiàn)有草莓品種資源進行徹查，篩選高效標記構(gòu)建指紋圖譜并進行親緣關(guān)系分析，以便為快速準確鑒定草莓品種提供技術(shù)支撐，對自有品種進行有效保護，同時顯著加快雜交育種的進程。

1 材料與方法

1.1 材料

17個南方主栽品種(表1)中除了紅實美、石莓四號和03-6-2為我國培育品種，其它都為國外引進品種。其中紅頰、豐香和章姬來自杭州市農(nóng)科院草莓圃，其他14個均由浙江省農(nóng)科院蔣桂華老師提供。為比較各品種間的親緣關(guān)系，本文也同時對杭州市農(nóng)科院引進的9個德國品種進行了比較研究。取新鮮嫩葉用液氮迅速冷凍處理，然后保存在-80℃冰箱中備用。草莓葉片總DNA提取采用改進的CTAB 法[11]。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參考文獻設(shè)計了8個RAPD引物[8]、6對SCAR引物[8]和10對 EST-SSR 引物[9]，分別編號為R1～8、S1～6和E1～10，由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.2.2 PCR擴增和產(chǎn)物檢測 PCR擴增在MG96+型PCR儀上進行，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同樣參考上述參考文獻[8-9]。RAPD、SCAR引物擴增以DNA marker DL2000為分子量標記，EST-SSR引物擴增以GeneRuler 100 bp作為分子量標記，分別用15 g/L瓊脂糖凝膠和8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳后進行常規(guī)銀染。在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR和Bio-Rad GS-800掃描儀上成相。

1.3 數(shù)據(jù)分析

選取帶型穩(wěn)定、主帶明顯、影子帶少、多態(tài)性信息含量較大的引物，確定為構(gòu)建指紋圖譜的核心標記引物。利用人工方法讀數(shù)，將每個核心標記引物擴增的各個等位點主帶型按遷移率由快到慢的順序編號，按主帶型的有無分別記為1、0，由核心標記引物擴增的主帶型記錄結(jié)果組合表示品種的指紋圖譜。利用軟件NTSYS-pc估算相似系數(shù)，采用UPGMA分析程序，繪制親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標記多態(tài)性分析

圖1 RAPD標記對13個草莓品種的多態(tài)性擴增Fig.1 Amplification products obtained from isolates using marker R6 in 13 cultivars.

24個引物對地域來源不同的Tenira與紅頰DNA模板進行PCR擴增試驗，取能擴增出產(chǎn)物的引物對所有26個DNA進行擴增，分析其多態(tài)性。結(jié)果，24個引物中，除了引物S4和S5，有22個能對Tenira與紅頰基因組DNA擴增出產(chǎn)物，引物可用率達到91.7%。除了引物R1、R2、R5和E1，其余18個引物表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性引物占可用引物的81.8%。圖1、2、3 分別為 RAPD 引物 R6、SCAR 引物(S1、S3)、EST-SSR 引物(E2、E3、E4、E7、E8)對不同草莓品種的多態(tài)性擴增。

圖2 SCAR標記對26個草莓品種的多態(tài)性擴增Fig.2 Amplification products obtained from isolates using SCAR markers in 26 cultivars.

圖3 EST-SSR標記對26個草莓品種的多態(tài)性擴增Fig.3 Amplification products obtained from isolates using EST-SSR markers in 26 cultivars.

2.2 草莓指紋圖譜的建立

上圖中除RAPD引物外的其它7對引物帶型穩(wěn)定、多態(tài)性信息含量相對較大，被確定為構(gòu)建指紋圖譜的核心標記引物。根據(jù)核心引物的擴增情況，對它們在26個品種中擴增的多態(tài)性帶型進行總結(jié)，標記 A-G 分別有4、11、5、7、4、2、2 種帶型(圖4)。

圖4 7個核心標記在26個品種中擴增的多態(tài)性帶型Fig.4 Polymorphic band types obtained from isolates using 7 core markers in 26 cultivars

根據(jù)擴增及計算結(jié)果，26個品種的指紋圖譜見表1。由表1可知，7個標記的引物擴增帶型能形成Gento、Tenira、Rimona、aroma、bellarosse、Kletter、Ferma、佐賀清香、寶交早生、童子一號、法蘭第、花姬、紅實美、章姬、紅頰、豐香、千禧、櫪乙女、石莓四號、03-6-2和海玉這21個品種的特異指紋圖譜，使它們相互區(qū)分。作為自有品種的03-6-2，如果在今后進行大面積推廣應(yīng)用，完全可以用指紋圖譜進行品種保護。

由表1還可看出，達塞、弗吉尼亞和鬼怒甘，Elvira和Stugarta的指紋圖譜相同，這7個標記引物擴增的帶型組合仍然不能使它們相互區(qū)分。

表1 26份草莓資源的名稱、來源和特征指紋代碼Tab.1 Name ，origin and fingerprinting code of 26 strawberry Germplasm

2.3 親緣關(guān)系分析

將每個核心標記引物擴增帶型的1、0數(shù)據(jù)，制成Excel文件用于聚類分析。使用NTSYS-pc軟件估算相似系數(shù)，采用UPGMA分析程序，繪制親緣關(guān)系樹狀圖(圖5)。

圖5 26個草莓品種的分子標記聚類圖Fig.5 Dendrogram of 26 strawberry cultivars

由圖5可以看出，26個草莓品種在相似系數(shù)0.63處可以分為4個主要類群，南方主栽引進品種為一個類群(除Gento)，德國品種分3個類群。從相似系數(shù)表看出，8個德國品種中親緣關(guān)系最遠的是aroma和bellarosse為0.32，最近的是Elvira和Stugarta為1，平均相似系數(shù)為0.58。南方主栽引進品種相似系數(shù)最遠的是03-6-2分別與豐香和海玉為0.59，最近的是達塞和弗吉尼亞和鬼怒甘為1，平均相似系數(shù)為0.79，遠高于德國引進品種的平均相似系數(shù)。這說明南方主栽引進品種的親緣關(guān)系較近，主要原因可能是日本草莓品種雜交親本重疊較多，比如，章姬為紅實美、紅頰的親本之一，寶交早生為石莓四號的親本之一，雜交種與親本的相似系數(shù)都高達0.86，女峰為章姬的親本之一，而鬼怒甘從女峰變異株中選出，相似系數(shù)高達0.96。弗吉尼亞為紅實美的親本之一，它們的相似系數(shù)為0.82。而達塞、弗吉尼亞與章姬，花姬與紅頰，紅實美與櫪乙女，佐賀清香與童子一號，它們的相似系數(shù)也都達到了0.96，其遺傳關(guān)系因為某些品種的親本來源不明而不甚清楚。Elvira和Stugarta不能區(qū)分，達塞、弗吉尼亞和鬼怒甘不能區(qū)分，它們極有可能是同種異名的草莓品種。千禧與櫪乙女為同種異名的品種，但實驗結(jié)果它們的相似系數(shù)為0.86而非1。這些都有待于進一步的研究，比如材料的進一步確定和標記數(shù)目的增加等。其它品種在一定相似水平上可以相互區(qū)分，此結(jié)果與指紋圖譜結(jié)果完全吻合。

有些品種雖然不屬于同一個地區(qū)，但是親緣關(guān)系卻很近，如Gento與南方主栽引進品種的親緣關(guān)系比它與德國品種更近，與03-6-2達到了0.86。相反，有些品種雖然屬于同一地區(qū)，但是親緣關(guān)系卻很遠，如同為日本品種的佐賀清香與鬼怒甘，寶交早生、章姬與千禧，豐香、海玉與紅頰，相似系數(shù)只為0.68。造成這種現(xiàn)象的原因有很多，比如頻繁的異地引種、品種之間具有共同的親本、生長條件和自然選擇條件相仿等，可能由上述一種或多種因素共同作用而致。

3 討論

常規(guī)的草莓品種鑒定經(jīng)常通過外觀形態(tài)觀察來進行，往往鑒定周期長，誤差較大，一些性狀差異小的品種更是難以鑒定。我國南方主栽的草莓品種多引自國外，特別在近幾年草莓種植業(yè)飛速發(fā)展的背景下，引種的力度更是增強。這也導(dǎo)致目前某些引進品種存在同種異名的現(xiàn)象，造成引進和品種利用時嚴重的人力物力浪費。DNA分子標記反映的是遺傳本質(zhì)上的差異，用于品種鑒定時具有周期短，不受環(huán)境條件的影響，真實可靠等優(yōu)點。本文首次利用分子標記構(gòu)建了紅頰、章姬、豐香等14個南方優(yōu)質(zhì)主栽品種和7個德國新引進品種的指紋圖譜，使它們完全區(qū)分。并對26個草莓品種親緣關(guān)系分析，為目前已經(jīng)趨于混亂的南方引進和主栽草莓品種的鑒定提供有效的技術(shù)支撐。隨著品種數(shù)量的進一步增加，這7個引物組合的鑒別能力會逐漸減低，但可以根據(jù)實際檢測情況增加引物組合的數(shù)量。此外，利用分子標記技術(shù)確定作為親本的品種間的遺傳距離，指導(dǎo)雜交育種親本選配，為提高育種效率提供理論依據(jù)。

本文所用的RAPD標記一直得不到穩(wěn)定擴增結(jié)果，可靠性較差，決定了它不適合用于指紋圖譜的構(gòu)建。擴增結(jié)果較穩(wěn)定的EST-SSR標記和SCAR標記成了本研究的主要工具，但本文所用引物來源于已開發(fā)的標記，數(shù)量較少，而且多態(tài)性極高的標記更少。本文沒有區(qū)分出的鬼怒甘和弗吉尼亞品種，利用AFLP標記進行分析[6]，雖然親緣關(guān)系非常接近，但還是能區(qū)分出來。因此說明本文所用的SSR標記數(shù)目不夠多，而目前常用的從公共數(shù)據(jù)庫EST序列中篩選并建立EST-SSR標記的技術(shù)，為本研究的進一步深入提供了快速經(jīng)濟的有效方法。

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