朱芝秀，何后軍，張文波，鄔向東，萬(wàn) 根，鄧舜洲，劉松林

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，江西 南昌 330045)

嗜水氣單胞菌廣泛存在淡水、污水、淤泥及土壤中，其致病性菌株可產(chǎn)生氣溶素、溶血素、細(xì)胞毒性、腸毒素、胞外蛋白等。該菌的感染譜廣，可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等動(dòng)物。嗜水氣單胞菌是典型的人－獸－魚共患病病原菌[1]，也是我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚暴發(fā)性傳染病的主要病原之一[2]，該病的高發(fā)期為每年的5—10月，此時(shí)溫度適宜，水體中嗜水氣單胞菌大量繁殖，可引起該病的爆發(fā)。

長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物病害控制主要依靠各種抗菌藥物及消毒劑。長(zhǎng)期濫用藥物，不僅使藥物作用受到制約，延誤治病，造成大量死亡和藥物投入的雙重?fù)p失，還可誘發(fā)細(xì)菌基因突變或因轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致無(wú)藥可用，更嚴(yán)重的是藥物在魚體內(nèi)殘留和對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的嚴(yán)重污染，違背發(fā)展無(wú)公害食品的宗旨，危害人體健康，破壞水體生態(tài)環(huán)境。因此，尋找新的環(huán)境友好病害防控措施，使我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展已迫在眉睫。

EM(Effective Microorganisms)微生態(tài)制劑由光合細(xì)菌、乳酸菌群、酵母菌群、放線菌群、絲狀菌群等5科10屬80余種微生物組成。它是由世界著名應(yīng)用微生物學(xué)家日本琉球大學(xué)比嘉照夫教授發(fā)明的，EM技術(shù)是目前世界上應(yīng)用范圍最廣的一項(xiàng)生物工程技術(shù)。EM體內(nèi)抑菌機(jī)理:在動(dòng)物消化道內(nèi)產(chǎn)生有益菌群，與致病菌間就生存和繁殖的空間、時(shí)間、定居部位以及營(yíng)養(yǎng)素等展開競(jìng)爭(zhēng)，抑制致病菌的生存、繁殖、定居以及附著[3]。EM在養(yǎng)殖水體中的抑菌機(jī)理:EM滲入水體后，它就會(huì)與所到之處的良性力量迅速結(jié)合，產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)，清除氧化物質(zhì)，消除腐敗，抑制水中的病原菌，形成適于動(dòng)植物生長(zhǎng)的良好環(huán)境。同時(shí)，它還產(chǎn)生大量易為動(dòng)植物吸收的有益物質(zhì)，凈化養(yǎng)殖池中的排泄物和殘餌，改善水質(zhì)，減少魚病[4]。EM具有無(wú)毒副作用、無(wú)耐藥性、無(wú)殘留、低成本、效果顯著等特點(diǎn)，有效地克服抗生素、激素、防腐劑、農(nóng)藥、化肥等化學(xué)農(nóng)業(yè)所產(chǎn)生的種種副作用。使用微生態(tài)制劑是實(shí)施水產(chǎn)健康養(yǎng)殖的一項(xiàng)重要技術(shù)手段[5]。

本實(shí)驗(yàn)首先分離鑒定魚體和養(yǎng)殖水體中的致病性嗜水氣單胞菌，在此基礎(chǔ)上，研究EM對(duì)致病性嗜水氣單胞菌的抑制作用，為今后EM在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病料:取自江西某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的病魚和養(yǎng)殖水。細(xì)菌微量生化反應(yīng)管:購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。藥敏試紙:購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。EM:購(gòu)自江西省天意生物技術(shù)開發(fā)有限公司。嗜水氣單胞菌16S rDNA和Aero基因的特異性擴(kuò)增引物:由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基:購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。牛津杯:內(nèi)徑為8 mm。

1.2 方法

1.2.1 嗜水氣單胞菌的分離 無(wú)菌操作取病魚肌肉接種普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。將養(yǎng)殖水涂布胰蛋白酶瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 分離菌純化培養(yǎng) 挑選形態(tài)一致的疑似菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，劃線接種普通瓊脂培養(yǎng)基純化，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 分離菌株分子生物學(xué)檢測(cè) 按照李紹戊等[6]方法，對(duì)分離菌株進(jìn)行嗜水氣單胞菌的保守基因16S rDNA基因及特異性Aero基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。

1.2.4 嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)曲線圖繪制 選取一株嗜水氣單胞菌分離株，無(wú)菌操作接種10支普通肉湯，37℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)。相隔一定時(shí)間定期取樣，測(cè)定每份樣品的OD630值，以O(shè)D630值為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.5 藥敏實(shí)驗(yàn) 將分離菌分別接種普通肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，按瓊脂擴(kuò)散法用14種抗生素做藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 EM體外抑制實(shí)驗(yàn) 將分離菌株肉湯培養(yǎng)物均勻涂布普通瓊脂培養(yǎng)基，將不同濃度的EM小心滴入牛津杯內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h，分別測(cè)量抑菌圈大小。

2 結(jié)果和分析

2.1 嗜水氣單胞菌分離結(jié)果

從病魚肌肉和水體中共分離純化到14株細(xì)菌，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形成表面光滑、隆起、濕潤(rùn)的乳白色菌落，在胰蛋白酶瓊脂培養(yǎng)基形成透明溶蛋白圈的中等大小菌落，菌體均為革蘭氏陰性桿菌。

2.2 分離菌株分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果

14株分離菌株均擴(kuò)增到嗜水氣單胞菌16S rDNA，其中7株擴(kuò)增到氣溶素基因(Aero基因)。與Gen-Bank已經(jīng)登錄的嗜水氣單胞菌16S rDNA和氣溶素基因之間的同源性分別為97.9% ～100% 和97.1% ～100%。因此，可確定14株分離菌均為嗜水氣單胞菌，其中7株為攜帶氣溶素基因的分離菌株為致病性嗜水氣單胞菌。

2.3 分離菌株生長(zhǎng)曲線

Jxg－1株生長(zhǎng)曲線(圖1)表明，在本試驗(yàn)條件下嗜水氣單胞菌培養(yǎng)21 h后進(jìn)行停滯期。因此，本試驗(yàn)以18 h的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

圖1 分離菌株Jxg－1的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of Aeromonas hydrophila isolate Jxg－1

2.4 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表1。本試驗(yàn)的嗜水氣單胞菌分離株對(duì)部分藥物呈現(xiàn)一致的耐藥性，14株菌對(duì)青霉素G、氨芐西林、頭孢拉定、頭孢唑啉、四環(huán)素、甲氧嘧啶、林可霉素、頭孢氨芐均耐藥;對(duì)頭孢噻肟和呋喃唑酮表現(xiàn)高度敏感;對(duì)強(qiáng)力霉素、頭孢砒肟、大觀霉素、乙酰螺旋霉素的耐藥性表現(xiàn)不一。

表1 嗜水氣單胞菌分離菌株對(duì)14種抗生素的耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Drug risistance test of 14 Aeromonas hydrophila isolates cm

2.5 EM體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

EM對(duì)14株嗜水氣單胞菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表2，結(jié)果表明:EM對(duì)嗜水氣單胞菌的體外抑制作用與濃度呈正相關(guān)，濃度大于60%則對(duì)14株菌種均有抑制作用，濃度越大，抑菌圈越大。

3 結(jié)論與討論

嗜水氣單胞菌廣泛存在于淡水、污水、淤泥及土壤中，如水體中的營(yíng)養(yǎng)豐富、水溫適宜，致病性嗜水氣單胞菌大量增殖，可導(dǎo)致大量魚發(fā)病。本試驗(yàn)從病魚和水體中共分離到14株分泌蛋白酶的細(xì)菌，通過(guò)16S rDNA基因的擴(kuò)增和測(cè)序列證明均為嗜水氣單胞菌，通過(guò)對(duì)嗜水氣單胞菌氣溶素基因(Aero基因)的擴(kuò)增表明其中的7株為致病性嗜水氣單胞菌[7]。從病魚和水體中分離到的致病性嗜水氣單胞菌的生化特性和對(duì)藥物的敏感性基本一致，且部分菌株的16S rDNA基因和Aero基因的同源性為100%，表明病魚的嗜水氣單胞菌是通過(guò)水體感染。

本試驗(yàn)分離的嗜水氣單胞菌均對(duì)青霉素、阿莫西林、頭孢類抗生素表現(xiàn)耐藥，對(duì)其他抗菌藥藥物也表現(xiàn)不同程度的耐藥性，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[8－11]，如果水產(chǎn)養(yǎng)殖中長(zhǎng)期使用抗菌藥物，則耐藥譜會(huì)越來(lái)越廣。EM是一種復(fù)合微生物菌劑，它由光合細(xì)菌、乳酸菌、放線菌等10個(gè)屬80多種微生物復(fù)合培養(yǎng)而成，具有促進(jìn)動(dòng)、植物生長(zhǎng)，去除糞便惡臭，改善生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的抗病力和免疫力等功效。因此，EM應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，具有凈化水質(zhì)、促進(jìn)生長(zhǎng)、提高成活率、減少病原菌的作用[12－15]，因此可減少水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗菌藥物的使用。本試驗(yàn)通過(guò)EM對(duì)嗜水氣單胞菌的體外抑菌作用進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明EM在體外具有抑制嗜水氣單胞菌增殖的作用，抑菌作用與濃度呈正相關(guān)，但其對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌機(jī)理及抑菌成分仍不完全清楚，有待進(jìn)一步研究。

表2 不同濃度EM對(duì)分離菌體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Antibacterial effect in vitro of different dilution EM on Aeromonas hydrophila cm

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