趙大顯，陳敏文，江 坤，吳小平*

(1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330031;2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330031)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國重要增養(yǎng)殖對象之一，近年來，由細菌、病毒和類立克次體生物等引起的各種疾病日趨嚴重，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失，嚴重制約了我國蟹類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。而目前蟹病主要采用抗生素等藥物進行防治，這無形中也對病原菌進行了耐藥性篩選，促成了病原菌的基因變異，提高了它們的抗藥性，從而有惡性循環(huán)的潛在可能。因此，研究中華絨螯蟹的免疫機制，有效提高蟹類本身的抗病能力，越來越受到人們的重視。國內(nèi)學(xué)者先后從生理生化水平對中華絨螯蟹免疫防御機制進行了探討[1－4]，近年來，又逐漸向分子水平深入，獲得了一些與免疫相關(guān)的表達序列標簽(ESTs)和基因序列[5－8]。這些研究將有助于更好的了解中華絨螯蟹和病原之間的關(guān)系，也為今后研究該物種的抗病分子機理奠定了基礎(chǔ)。

嗜水氣單胞菌(Aeromonaz hydrophila)作為一種重要的人－獸－魚共患病病原，在自然界分布廣泛，可以感染多種水生及陸生動物并引起不同的疾病，給人類的健康帶來威脅同時也給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成慘重的經(jīng)濟損失，危害性極大。Zhu[9]從患病瀕死的中華絨螯蟹肝胰腺中分離到3株嗜水氣單胞菌也均能引起健康蟹的死亡，從而發(fā)現(xiàn)該菌也是引起中華絨螯蟹患病的重要病原之一。

抑制性消減雜交技術(shù)(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)是近年來發(fā)展起來的一項新的分離、克隆差異基因的技術(shù)，該技術(shù)具有假陽性率低、篩選效率高、實驗周期短等優(yōu)點，能有效地分離擴增低豐度差異表達的基因[10]。本研究利用該技術(shù)，成功構(gòu)建了嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)下中華絨螯蟹差異表達基因的cDNA文庫，并對該文庫進行了初步分析，為進一步開展該物種抗病相關(guān)基因的篩選、克隆和功能分析奠定了基礎(chǔ)，同時也為中華絨螯蟹大規(guī)模細菌性疾病的檢測、控制提供了有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與實驗菌株 中華絨螯蟹成體(50～100 g)購于南昌市墩子塘水產(chǎn)市場，于實驗室暫養(yǎng)一周后選取健康、活潑且四肢健全的蟹用于試驗。嗜水氣單胞菌為本實驗室保存菌種。

1.1.2 感染與血淋巴細胞收集 在感染組中，中華絨螯蟹體側(cè)肌肉注射0.1 mL 7.2×108 CFU/mL嗜水氣單胞菌[8]，同時對照組注射0.1 mL無菌生理鹽水。在12 h內(nèi)連續(xù)觀察，待中華絨螯蟹出現(xiàn)個體明顯活動異常或個別死亡時抽取血淋巴，4℃，12 000 r/min離心10 min，收集血淋巴細胞。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA抽提和mRNA的分離 于血淋巴細胞中按0.1 g/mL加入Trizol Reagent(Invitrogen)，振蕩混勻，加入等體積的氯仿，蓋緊蓋子，顛倒搖動15 s，室溫放置2～3 min;4℃，13 000 r/min離心20 min，取上清，移至新的EP管中;向EP管中加入0.8倍體積的異丙醇，混勻，－20℃沉淀1 h，4℃，13 000 r/min離心20 min;棄上清，加入75%乙醇洗滌，溶于一定體積的DEPC水中。用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和純度，根據(jù)其濃度，取約150 ng進行凝膠電泳分析，觀察是否被降解;在確定該總RNA未被污染的前提下，取約600 μg的總RNA，按Oligotex mRNA Kit的方法分離mRNA。取1 μL獲得的mRNA用于凝膠電泳，用紫外分光光度計檢測OD260/OD280的比值，取約0.5 μg用于合成cDNA。

1.2.2 抑制性消減雜交 采用Clontech公司提供的PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit進行抑制性消減雜交，具體操作步驟參照試劑盒的操作手冊。其中正向雜交以嗜水氣單胞菌感染后的中華絨螯蟹血淋巴細胞mRNA為tester，以生理鹽水處理的中華絨螯蟹血淋巴細胞mRNA為driver;反向雜交以生理鹽水處理的中華絨螯蟹血淋巴細胞mRNA為tester，經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后的中華絨螯蟹血淋巴細胞mRNA 為 driver。

1.2.3 消減效率的檢測 用中華絨螯蟹β－actin特異的上游引物:5'－GCATCCACGAGACCACTT ACA－3'，下游引物:5'－CTCCTGCTTGCTGATCCACATC－3'，對消減后第2次PCR產(chǎn)物進行消減效率分析。同時，以未經(jīng)消減雜交的cDNA(在制備Tester cDNA連接2種接頭時，將剛好加樣還未進行連接反應(yīng)的Tester1－1 cDNA和Tester1－2 cDNA各取2:l混合，進行連接反應(yīng)完成)作為對照進行PCR，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃，30 s;60℃，30 s;72℃，1 min擴增，33個循環(huán)，分別在第18、23、28、33循環(huán)處各取5 μL進行電泳，檢測消減效率。

1.2.4 消減文庫的構(gòu)建及檢測 將第2次PCR的產(chǎn)物連接到Promega公司提供的載體pGEM-T easy，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞，用氨芐青霉素和藍白斑法篩選陽性克隆。隨機挑取15個陽性克隆進行PCR檢測，引物為Nesetd PCR Primer l和Nested PCR Primer 2R。隨機從文庫中挑取54個陽性克隆送樣測序。

1.2.5 序列分析與同源性比對 利用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行去除載體及接頭序列、剔除重復(fù)序列分析，獲得部分差異表達序列標簽(ESTs)，將獲得的ESTs序列提交到NCBI使用BLASTn進行序列相似性搜素，并初步推斷差異表達基因的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA電泳鑒定

提取的感染組和對照組中華絨螯蟹血淋巴細胞總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，總RNA以18 S條帶為主，未見彌散現(xiàn)象，說明總RNA未發(fā)生降解(圖1)，達到了構(gòu)建文庫要求。

圖1 中華絨螯蟹總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of Eriocheir sinensis total RNA

圖2 雙鏈cDNA電泳圖Fig.2 Electrophoresis of Eriocheir sinensis cDNA

2.2 SMART cDNA 合成

提取的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成第一、第二鏈cDNA，獲得雙鏈cDNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，雙鏈cDNA為彌散狀條帶，片段大小均大于0.1 kb(圖2)，符合試驗要求。

2.3 Rsa I酶切

對雙鏈DNA進行酶切后電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶切后的片段明顯較未經(jīng)酶切片段減小(圖3)，說明酶切效果較好，可以進行下一步cDNA接頭的連接。

2.4 接頭連接效率分析

雙鏈cDNA與接頭連接效率的高低是決定抑制性消減雜交成敗非常關(guān)鍵的一步。利用中華絨螯蟹管家基因β－actin上下游特異性引物以及試劑盒所帶的3'端特異性引物與PCR primer 1對兩組分別連接有接頭1和接頭2的cDNA進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，管家基因的3'端特異引物與接頭的外側(cè)引物primer 1組合的擴增片段大于管家基因3'、5'端特異引物組合的擴增片段，且以β－actin內(nèi)部特異引物和接頭引物組成的引物組擴增產(chǎn)物亮度超過以β－actin 2個特異引物為引物組擴增產(chǎn)物亮度的1/4(圖4)，說明連接效果較好，接頭的連接效率至少達到25%，可以用于消減雜交。

2.5 第一輪PCR

用接頭序列的外側(cè)引物對消減雜交產(chǎn)物進行第一輪PCR擴增，30個循環(huán)后，正向和反向消減雜交產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物均呈彌散狀條帶(圖5)。

圖3 Rsa I酶切分析Fig.3 Reverse transcription cDNA of Eriocheir sinensis after Rsa I digestion and not Rsa I digestion

圖4 接頭連接效率檢測Fig.4 Test of adaptors ligation efficiency

圖5 消減產(chǎn)物第一輪PCRFig.5 The first PCR result of subtractive hybridization product

圖6 消減產(chǎn)物第二輪PCRFig.6 The second PCR result of subtractive hybridization product

2.6 第二輪PCR

用接頭序列的內(nèi)側(cè)引物對第一輪PCR稀釋產(chǎn)物進行第二次PCR擴增(巢式PCR)，15個循環(huán)后發(fā)現(xiàn)，第二輪PCR產(chǎn)物為0.2～1.5 kb之間的大小不一條帶(圖6)。

2.7 消減文庫的質(zhì)量檢測

將第二次PCR擴增產(chǎn)物與pGEM－T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，進行消減cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建。隨機從文庫挑取15個陽性克隆，以Nesetd PCR Primer l和Nested PCR Primer 2R為引物進行菌落PCR擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，插入cDNA片斷的大小主要集中在100～1 000 bp之間(圖7)，表明所構(gòu)建文庫質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)的測序分析。

圖7 菌落PCR檢測消減cDNA文庫克隆插入片段大小Fig.7 Identification of the inserted cDNA fragment in subtractive cDNA library by PCR

2.8 差異表達的EST序列分析

將54個陽性克隆送樣測序，測序結(jié)果通過DNAMAN軟件分析，獲得37條EST序列。將獲得序列提交到NCBI選擇BLASTn進行比對發(fā)現(xiàn)，有6條ESTs與其他物種的免疫基因序列具有較高的同源性(表1)，說明所構(gòu)建的文庫達到了富集抗病相關(guān)基因的目的，可用于下一步免疫相關(guān)基因的篩選和功能分析。

表1 免疫相關(guān)的差異表達片段BLAST同源性比對結(jié)果Tab.1 BLAST analysis result of differentially expressed immune-related segments

3 討論

起始總RNA和mRNA的質(zhì)量和完整性是差異表達cDNA文庫能否成功構(gòu)建的關(guān)鍵步驟之一。從圖1可見，本試驗所提取的血淋巴細胞總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)有18 S、28 S和5 S三條清晰的條帶，說明提取的總RNA具有很好的完整性。一般認為，在真核生物中，總RNA在正常情況下28 S rRNA的亮度約為18 S rRNA的兩倍[11]，但本試驗發(fā)現(xiàn)，28 S rRNA的亮度低于18 S rRNA，這種現(xiàn)象在中國對蝦[12]和凡納濱對蝦[13]中也存在。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能有四點:一是試驗過程中有部分28 S rRNA被降解;二是中華絨螯蟹總RNA的28 S rRNA比18 S rRNA少;三是RNA在電泳過程中28 S rRNA更易形成二級結(jié)構(gòu);四是不同物種間總RNA的28 S rRNA和18 S rRNA比例不同所致[13]。另外，在文庫構(gòu)建過程，從反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及RasⅠ酶切檢測、加接頭連接效率到消減cDNA片段的消減效率分析等每個環(huán)節(jié)都進行實時監(jiān)控，保證每步獲得的結(jié)果達到后續(xù)試驗的要求，確保獲得高質(zhì)量的差異表達cDNA文庫。從菌落PCR擴增及陽性克隆測序結(jié)果可以看出，所獲得的陽性克隆片段大小具有很好的多態(tài)性，同時一些與抗病相關(guān)的基因得到了富集。

通過進一步對隨機挑取的54個陽性克隆進行測序和序列比對發(fā)現(xiàn)，有6條EST序列與免疫相關(guān)。其中，Hem 01與油橄欖(Olea europaea)類甜蛋白(Thaumatin-like protein，TLP)基因序列相似性達到100%，該基因已被證實具有顯著的抗真菌活性，一些轉(zhuǎn)TLPs基因的植物對于真菌性病害的抗性也顯著增強[15]。Hem 02與栽培蘋果(Malus domestica)金屬硫蛋白(metallothionein，MT)基因序列相似性為100%，已有研究表明，該基因在中華絨螯蟹先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要功能[16]。作為先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是生物的一種模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，它主要通過識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)來啟動免疫反應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)TLRs在炎癥、細胞凋亡、腫瘤等發(fā)生過程中扮演重要角色，同時具有介導(dǎo)抗真菌感染信號轉(zhuǎn)到的功能。本研究從文庫中篩選的Toll樣受體(Hem 03)及已報道的從中華絨螯蟹cDNA文庫中獲得的該基因EST序列[5]表明，Toll樣受體在該物種抗病過程中具有重要的功能，對該基因的進一步研究將有助于更深入的了解中華絨螯蟹的免疫應(yīng)答機制。Crustin是一類具有廣譜抗菌活性的抗菌肽，研究表明，Crustin普遍存在于甲殼動物(蟹、對蝦、龍蝦、螯蝦等)血淋巴中，對細菌和真菌均有抗菌活性[17－18]。本研究篩選到的該基因(Hem 04)與大西洋小龍蝦(Nephrops norvegicus)相似性為97%，且該基因已被證實參與了中華絨螯蟹的先天免疫應(yīng)答反應(yīng)[19]。另外，有研究表明，從文庫中篩選獲得的組織蛋白酶基因(Hem 04)也與中華絨螯蟹抗病相關(guān)[20]。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)是多種免疫細胞的骨泌或旁分泌調(diào)節(jié)因子，在特異性抗原等刺激下，核巨噬細胞和淋巴細胞被激活，產(chǎn)生并釋放TGF。這些免痤細胞都有TGF受體，激活后所釋放的TGF以自分泌或旁分泌方式反饋作用于這些細胞。幾乎所有的正常細胞表面都有TGF受體，現(xiàn)已知有三種高親和性的細胞膜受體，稱為I型、Ⅱ型和Ⅲ型受體。其中，I型受體是糖蛋白，是一種跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要介導(dǎo)TGF對細胞外基質(zhì)作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]。本研究篩選到的轉(zhuǎn)化生長因子受體基因(Hem 06)將有助于進一步了解中華絨螯蟹免疫信號識別及傳遞途徑和機制。

以上結(jié)果表明，本研究獲得了中華絨螯蟹高質(zhì)量的差異表達cDNA文庫，可用于后續(xù)大規(guī)模測序及EST分析，并且可以從該文庫中篩選出一些差異表達的與免疫相關(guān)的基因序列。對這些基因序列可進一步通過設(shè)計引物，進行基因全長擴增，并對其功能進行研究，為闡述中華絨螯蟹先天免疫反應(yīng)的分子機制提供理論依據(jù)。

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