張若曦， 丁 越， 張 彤， 王慶其， 鄒純樸， 陶建生

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

芩麻方為上海中醫(yī)藥大學(xué)教授、名老中醫(yī)裘沛然的經(jīng)驗方。由麻黃、細辛、龍膽、黃芩、干姜、訶子、甘草組成。本方在小青龍湯基礎(chǔ)上，以麻黃宣肺平喘為君藥;細辛、干姜性辛溫，功能溫肺化飲，合龍膽草、黃芩清熱燥濕，兩組寒熱并用，相反相成為臣藥;訶子斂肺止咳，與麻黃相配伍，一散一收，相激而成，為佐藥;甘草調(diào)和諸藥。故本方具有寒熱并用，斂散相伍的配伍特點，主治寒邪痰熱內(nèi)蘊之哮喘、咳嗽?，F(xiàn)代臨床多用于支氣管哮喘以及慢性支氣管炎的治療。麻黃作為芩麻方中的君藥，其主要成分鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿常被看作是該方的藥用基礎(chǔ)之一，具有舒張支氣管平滑肌和抗炎抗病毒作用作用，可以有效地治療支氣管哮喘和慢性支氣管炎［1-4］。在采用現(xiàn)代制藥技術(shù)開發(fā)芩麻方新藥的研究過程中，發(fā)現(xiàn)芩麻方中其他藥材與麻黃混煎時，對麻黃中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的提取效率有一定的影響。因此，本實驗以麻黃中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的提取效率為指標，建立麻黃提取液及藥材中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的測定方法，研究芩麻方中各味藥材對麻黃中有效成分提取效率的影響，優(yōu)化芩麻方中麻黃的提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 series高效液相色譜儀 (VWD檢測器、四元恒流泵、在線脫氣機、自動進樣器)，美國安捷倫公司;XS105DU電子天平，梅特勒-托利多 (中國)，SB3200超聲波清洗器，寧波新芝生物科技公司，色譜柱為Welch Materials:XB-C18色譜柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

1.2 藥品及試劑 麻黃藥材 (購于康橋飲片廠，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心李俊松高級實驗師鑒定為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinicaStapf的干燥草質(zhì)莖);鹽酸麻黃堿對照品，鹽酸偽麻黃堿對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號171241-201007、171237-200807，供定測使用;甲醇為色譜純;水為純凈水;其他試劑均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

2 麻黃提取液及藥材中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿HPLC測定方法的研究

2.1 麻黃提取液的制備 取麻黃藥材50 g，精密稱定質(zhì)量，加10倍量水，浸漬30 min，煎煮3次，每次1 h，濾過，合并3次濾液，按藥材比量法濃縮至2 g/mL，即得麻黃水煎液。

2.2 鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿HPLC測定方法

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品7.95 mg、8.20 mg(純度分別為99.7%和99.9%)，置于50 mL量瓶中，用0.1 mol/L的鹽酸溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.159、0.164 mg/mL的混合對照品溶液，作為母液，4℃保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 麻黃藥材供試品的制備:參考《中國藥典》2010年版一部麻黃項下收載的含量測定樣品制備方法［5］。

麻黃提取液供試品的制備:取2.1項下麻黃提取液1 mL，加濃氨水2.5 mL(pH值約為10)，振搖，精密加入三氯甲烷50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用三氯甲烷補足減失的質(zhì)量，振搖，濾過，棄去初濾液。精密量取續(xù)濾液25 mL，加鹽酸乙醇 (1→20)溶液4 mL(pH值呈酸性)，置水浴上蒸干，殘渣加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中并定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過即得樣品。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑 (Welch Materials:XB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm);甲醇-0.1%磷酸水溶液 (含0.1%的三乙胺)10∶90為流動相;檢測波長207 nm。理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計均不低于4 000，色譜圖見圖1。

麻黃水提液和復(fù)方芩麻方提取液樣品色譜圖中具有與鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品保留時間一致的色譜峰，且與其他成分的色譜峰分離良好，且在復(fù)方芩麻方陰性樣品色譜圖中，未見干擾。

圖1 標準品 (A)、麻黃提取液 (B)、芩麻方提取液 (C)、芩麻方陰性樣品 (D)色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 以2.2.1項下制備的對照品溶液為母液，依次稀釋2倍，分別配制成鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度為2.48、4.97、9.94、19.88、39.75、79.50、159 μg/mL 和鹽酸偽麻黃堿質(zhì)量濃度為2.56、5.13、10.25、20.50、41、82、164 μg/mL的對照品溶液。分別吸取上述的對照品溶液各20 μL，進樣測定，每個質(zhì)量濃度重復(fù)進樣3針。以各質(zhì)量濃度下峰面積均值為縱坐標Y(mV·s)，麻黃堿的質(zhì)量濃度為橫坐標X(μg/mL)，繪制標準曲線，擬合方程分別為Y=38.72X+8.160 7(n=7)，r=1和Y=39.183X+6.940 8(n=7)，r=1，在2.48～159 μg/mL 和2.56～164 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗

2.2.5.1 日內(nèi)精密度 取3個不同質(zhì)量濃度水平的對照品溶液 (其中鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度分別為81.50、20.38、5.09 μg/mL，鹽酸偽麻黃堿質(zhì)量濃度分別為80.50、20.13、5.03 μg/mL)20 μL，重復(fù)進樣6次，測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的峰面積，計算鹽酸麻黃堿各質(zhì)量濃度下平均峰面積分別為242.5、967.7、3 916.4，RSD值為0.1%、0.1%、0，鹽酸偽麻黃堿各質(zhì)量濃度下平均峰面積分別為239.2、955.8、3 871.4，RSD值為0.1%、0、0。

2.2.5.2 日間精密度 取上述溶液，每個質(zhì)量濃度在連續(xù)5 d內(nèi)，每天分別進樣1針，計算鹽酸麻黃堿各質(zhì)量濃度下平均峰面積分別為 244.8、972.4、3924.3，RSD值為0.6%、0.8%、0.9%，計算鹽酸偽麻黃堿各質(zhì)量濃度下平均峰面積分別為241.6、960.6、3878.8，RSD值為1.0%、0.6%、0.9%。說明該測定方法精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性 取麻黃水煎液樣品1 mL，按2.2.2項進行供試品溶液制備方法處理，并進行HPLC測定，以標準曲線法定量并計算樣品中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的質(zhì)量濃度，平行操作六份，計算平均值與RSD值，結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿平均質(zhì)量濃度為106.1 mg/mL和51.9 mg/mL，RSD值為0.2%、0.3%，該測定方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性 取麻黃提取液樣品1 mL，按2.2.2項下制備供試品溶液1份，于樣品制得后的0、1、2、4、8、12與24 h進樣測定，記錄各時間點鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的峰面積，并計算RSD值，經(jīng)計算各質(zhì)量濃度下鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿平均峰面積為1 049.8和515.0，RSD值為0.8%和0.6%，說明供試品溶液中鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿在制備完成24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率 采用加樣回收率實驗方法，取已知量的麻黃水煎液，分別加入不同量的鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿 (80%、100%、120%)，按加樣樣回收實驗計算回收率，鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿的回收率分別為103.0%和97.2%，RSD值為1.4%和1.1%。說明本法具有良好的回收率，見表1，表2。

表1 麻黃提取液中鹽酸麻黃堿加樣回收率試驗 (n=9)

表2 麻黃提取液中鹽酸偽麻黃堿加樣回收率試驗 (n=9)

3 芩麻方中各味藥材對麻黃中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的提取效率的影響

將麻黃與芩麻方中其他藥材 (黃芩、甘草、細辛、龍膽、訶子、干姜)按1∶1比例50 g，按2.1項下麻黃提取液制備方法制備混煎水提液，結(jié)果見表3。提取效率按混煎液鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的量與50 g麻黃提取液的量之比來計算。

表3 芩麻方中各味藥材對于麻黃提取的影響 (n=3)

實驗結(jié)果顯示，麻黃與各味中藥分別混合煎煮后，芩麻方中的黃芩、細辛、龍膽、訶子、甘草均在一定程度上降低了麻黃有效成分的提取率;甘草對麻黃提取的影響最大，二藥合煎時鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的提取效率分別為39.3%和31.7%，有效成分損失嚴重。本實驗采用麻黃藥材單獨煎煮提取來優(yōu)化其工藝參數(shù)，以提高有效成分的提取率，提高制劑的臨床療效。

4 麻黃水提工藝正交試驗

預(yù)實驗結(jié)果表明，影響其水提效果因素主要有藥材的浸泡時間，煎煮時間和用水量等。通過正交實驗優(yōu)選水煎提取的最佳工藝，正交實驗設(shè)計見表4。

表4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)各指標影響作用的大小，本實驗依據(jù)其重要程度設(shè)置權(quán)重，鹽酸麻黃堿提取率∶鹽酸偽麻黃堿提取率=0.5∶0.5，計算各指標的P(Bi/Aj)，P(Bi/Aj)=Xij/Sij，綜合評分 (M)=0.5×P(B1/A1)+0.5×P(B2/A2)，上述各式中Bi為第i號實驗，Aj為第j個指標，Xij表示第j個指標下第i個測定值，Sj表示第j個指標下各次實驗結(jié)果的和值 (i=1，2，…，n，j=1，2，…，k)。見表5，表6。

表5 正交實驗設(shè)計表及結(jié)果

表6 綜合評價正交實驗方差分析結(jié)果

直觀分析結(jié)果顯示三因素的主次關(guān)系為B＞C＞A，最佳的工藝搭配為B3C3A1。由于因素A、C的離差平方和均小于誤差項因素D，故將其并入誤差項計算。綜合評價方差分析結(jié)果表明，麻黃水提過程中，煎煮時間 (B)為顯著性影響因素，選擇B3，藥材的浸泡時間 (A)、用水量(C)無顯著性影響，可根據(jù)生產(chǎn)實際情況適當(dāng)調(diào)整。優(yōu)選的工藝條件為藥材加水浸泡0.5 h，煎煮3次，每次煎煮1.5 h，每次用水量為藥材的10倍量。

5 最佳提取工藝確定與驗證

按正交分析實驗優(yōu)選提取工藝進行水提工藝驗證，平行制備3批樣品。測定水提液中鹽酸麻黃堿轉(zhuǎn)移率、鹽酸偽麻黃堿轉(zhuǎn)移率和浸膏得率，結(jié)果3批樣品中鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿的轉(zhuǎn)移率分別為79.4%、79.2%、79.8%和76.0%、75.9%、76.7%，RSD為0.57%和0.38%，表明麻黃水提工藝穩(wěn)定，見表7。

表7 最佳提取工藝確定與驗證

6 討論

麻黃提取液測定方法的考察時，以鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿提取率為指標考察了乙醚萃取法、三氯甲烷萃取法、三氯甲烷超聲法、氧化鋁柱層析法4種不同供試品的制備方法［6-11］。結(jié)果顯示同一份麻黃水煎液，三氯甲烷超聲法制備的樣品中鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿測定的量最高，又經(jīng)空白鹽酸麻黃堿對照品測定其萃取回收率為97.8%，故麻黃提取液供試品制備采用三氯甲烷超聲法。

采用HPLC建立的麻黃藥材及提取液中鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿的測定方法，樣品處理方法便捷，測定方法簡單，測定結(jié)果準確可靠，具有良好的重復(fù)性和回收率，可用于麻黃飲片和麻黃制劑中的質(zhì)量控制。

麻黃與各味中藥混合煎煮結(jié)果表明:復(fù)方芩麻方中的黃芩、細辛、龍膽、訶子、甘草均在一定程度上降低了麻黃有效成分的提取率，其中甘草對麻黃提取效率的影響最大，麻黃—甘草為酸堿藥對，合煎過程中可能產(chǎn)生沉淀導(dǎo)致化學(xué)成分變化，尤其是水煎液中的去甲基偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿5種生物堿的量均有不同程度的降低。推測可能因為甘草中的甘草酸與麻黃中的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿結(jié)合并生成沉淀，影響了本實驗對芩麻方有效成分鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的提取。這與李外等［12-14］的研究結(jié)果一致。

由于芩麻方提取時，各藥味間存在相互作用，如考慮鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的提取率，君藥麻黃應(yīng)與對甘草等藥味分別提取，以提高制劑的臨床療效。本實驗通過正交試驗優(yōu)選的最佳提取工藝為取適量的藥材，每次加水量為藥材的10倍量，煎煮3次，每次煎煮1.5 h。

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