楊麗+李瑩+王清嫻+孫勇兵+劉灣+李文宏

[摘要]目的 探討不同配比麻黃-杏仁藥對(duì)中麻黃堿、偽麻黃堿與苦杏仁苷多組分含量的變化規(guī)律。方法 選用U6（64）均勻設(shè)計(jì)表安排配比，采用高效液相色譜法測(cè)定麻黃-杏仁藥對(duì)不同配伍比例中麻黃堿、偽麻黃堿與苦杏仁苷的含量。結(jié)果 經(jīng)方法學(xué)考察，麻黃堿回歸方程為y=212.36x+0.6658，R2=0.9995；偽麻黃堿回歸方程為y=184.95x+0.7268，R2=0.9990；苦杏仁苷回歸方程為y=153.5x+2.4961，R2=0.9990；麻黃與杏仁配伍后，隨著配伍比例的變化，麻黃堿、偽麻黃堿的含量與麻黃用量、苦杏仁苷與杏仁用量之間均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好；麻黃-杏仁藥對(duì)中有效成分的含量與用藥量成正相關(guān)，而與配伍比例無(wú)明顯的相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]麻黃-杏仁藥對(duì)；麻黃堿；偽麻黃堿；苦杏仁苷

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）02（b）-0004-05

[Abstract]Objective To discuss the change rule between the different compatibility of ephedra-almond drugs and the multicomponent content variation of ephedrine，pseudo-ephedrine and amygdalin.Methods The U6（64） uniform design table was selected to plan proportions，and a simultaneous quantitative HPLC method was used for determination of the content of ephedrine，pseudo-ephedrine and amygdalin in different compatibility of ephedra-almond drugs.Results The regression equation of ephedrine was y=212.36x+0.6658，R2=0.9995；the regression equation of pseudo-oephedrine was y=184.95x+0.7268，R2=0.9990；the regression equation of amygdalin was y=153.5x+2.4961，R2=0.9990.After compatibility of ephedra and almond，the content of ephedrine，pseudo-ephedrine and ephedrine，amygdalin and almond showed a good linear relationship with the compatibility ratio.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible.The content of effective components of ephedra-almond drugs and dose is positive correlation，but it has no obvious correlation with compatibility proportion.

[Key words]Ephedra-almond drugs；Ephedrine；Pseudo-ephedrine；Amygdalin

麻黃辛散苦泄，有效成分主要為麻黃堿和偽麻黃堿，具有發(fā)汗、平喘、止咳、祛痰、利尿等藥理作用[1-4]，臨床上多用于水腫、咳喘、無(wú)汗、惡寒發(fā)熱、外感風(fēng)寒等癥狀的治療[5-6]。杏仁味苦微溫，有效成分為苦杏仁苷，主要有祛痰、止咳、平喘、潤(rùn)腸之功效[7-8]。兩藥配伍使用，麻黃宣肺氣，杏仁降肺氣，一宣一降，相輔相成[9]?！秱摗分新辄S湯、大青龍湯、麻黃杏仁甘草石膏湯、麻黃加術(shù)湯、麻黃杏仁薏苡甘草湯、厚樸麻黃湯、文蛤湯等皆為麻黃杏仁合用協(xié)同定喘[10-12]。譚曉梅等[13]研究證實(shí)了麻黃-杏仁配伍使用后確實(shí)比單用麻黃或杏仁有更好的平喘效果，同時(shí)降低苦杏仁毒性，并提出麻黃-杏仁能有效改善哮喘狀態(tài)的作用機(jī)制可能與降低嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和血小板數(shù)量有關(guān)。

中醫(yī)治療中，組方劑量配比的不同可能產(chǎn)生不同的治療作用[3，14-16]。為詮釋麻黃-杏仁配伍的科學(xué)內(nèi)涵，本研究選用U6（64）均勻設(shè)計(jì)表，即對(duì)麻黃、杏仁2個(gè)因素各取6個(gè)不同的水平并設(shè)計(jì)成6種配比，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）同時(shí)測(cè)定不同配伍比麻黃-杏仁藥對(duì)中麻黃堿、偽麻黃堿與苦杏仁苷的含量，探討不同配伍比麻黃-杏仁藥對(duì)中麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷多組分含量變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究不同配伍配比與平喘機(jī)制、療效之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1儀器與材料

1.1儀器

Waters 2998高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；超聲波清洗器（深圳市潔康洗凈電器有限公司）；臺(tái)式大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利儀器制造廠）。

1.2試藥與試劑

鹽酸麻黃堿對(duì)照品（國(guó)家食品藥品檢定研究院，批號(hào)：171241-201508）；鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品（國(guó)家食品藥品檢定研究院，批號(hào)：171237-201208）；苦杏仁苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：K01020CB14）；甲醇（山東禹王實(shí)業(yè)有限公化工公司，批號(hào)：20150629033）；磷酸（西隴化工股份有限公司，批號(hào)：140913-1）；三乙胺（西隴化工股分有限公司，批號(hào)：140222-1）；二正丁胺（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150603）；乙腈（天津康巢科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：20131123）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.3藥材

經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院付小梅副教授鑒定，麻黃為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinica Stapf.的干燥草質(zhì)莖（產(chǎn)地：甘肅，批號(hào)：15091069）；苦杏仁為薔薇科植物山杏Prunusarmeniaca L.var.ansu Maxim.的干燥成熟種子（產(chǎn)地：河北，炒苦杏仁，批號(hào)：15021533）。

1.4麻黃-杏仁藥對(duì)水煎液的制備

參照臨床煎藥方法，按照各配比方量精密稱取藥材，將稱取的麻黃藥材加入方藥總量8倍的水，浸泡30 min，加熱至沸騰，然后改用小火煎煮30 min，加入苦杏仁藥材煎煮40 min，趁熱過(guò)濾，量測(cè)煎液總?cè)萘?，留?0 ml，余下煎液濃縮，定容至1 g生藥/ml，煎液和濃縮藥液凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2方法與結(jié)果

2.1樣品中麻黃堿和偽麻黃堿的HPLC測(cè)定

2.1.1色譜條件 Phenomenex Syncrgi色譜柱（250 mm×4.6 mm，4 μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司），流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）=1.5∶98.5，流速為1.0 ml/min；柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μl。

按上述色譜條件，分別取麻黃堿-偽麻黃堿混合對(duì)照品溶液、麻黃-杏仁藥對(duì)供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，結(jié)果如圖1。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品麻黃堿0.0162 g、偽麻黃堿0.0157 g，分別用80%甲醇適量溶解，超聲5 min，置50 ml容量瓶中，定容；另取配制后等容量麻黃堿和偽麻黃堿溶液混合制成混合對(duì)照品溶液；配制得到濃度為1.62 μg/ml（麻黃堿）及1.52 μg/ml（偽麻黃堿）的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3供試品溶液的制備 將備用凍存煎液37℃水浴解凍，室溫靜置2 h，吸取1.5 ml，15 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔膜濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。

2.1.4陰性溶液的制備 按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備得到不含麻黃的陰性對(duì)照樣品。

2.1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精確吸取麻黃堿、偽麻黃堿對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、4、6、8、10 ml分別置于10 ml容量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，制得系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。溶液經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜濾過(guò)后，分別進(jìn)樣10 μl，按2.1.1所述色譜條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（μg/ml，x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。麻黃堿回歸方程為y=212.36x+0.6658，R2=0.9995；偽麻黃堿回歸方程為y=184.95x+0.7268，R2=0.9990。

2.2樣品中苦杏仁苷的HPLC測(cè)定

2.2.1色譜條件 Agilent TC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液15∶85，流速為1.0 ml/min；柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。進(jìn)樣量10 μl。

按上述色譜條件，取苦杏仁苷對(duì)照品溶液、麻黃-杏仁藥對(duì)供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，結(jié)果如圖2。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品苦杏苷0.0156 g，用80%甲醇適量溶解，超聲5 min，置50 ml容量瓶中，定容，配制得到濃度為3.12 μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.3供試品溶液的制備 將“2.1.3”項(xiàng)下的備用凍存煎液37℃水浴解凍，室溫靜置2 h，吸取1.5 ml，15000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔膜濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。

2.2.4陰性溶液的制備 按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備得到不含苦杏仁苷的陰性對(duì)照樣品。

2.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精確吸取苦杏仁苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、4、6、8、10 ml分別置于10 ml容量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，制得系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。溶液經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜濾過(guò)后，分別進(jìn)樣10 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（μg/ml，x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？嘈尤受栈貧w方程為y=153.5x+2.4961，R2=0.9990。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn) 分別精密吸取麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷對(duì)照品溶液各10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.11%、0.09%、0.17%，表明儀器精密度良好。

2.3.2重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備麻黃-杏仁藥對(duì)供試品溶液6份，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣10 μl，分別測(cè)定供試品溶液中麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷的峰面積。結(jié)果樣品中麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷峰面積RSD分別為1.54%、1.89%、0.93%，表明本文建立的HPLC檢測(cè)方法有著良好的重復(fù)性。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取麻黃-杏仁藥對(duì)供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h后進(jìn)樣10 μl，記錄峰面積。結(jié)果樣品中麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷峰面積RSD分別為0.78%、1.22%、1.04%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.3.4加樣回收率試驗(yàn) 按照“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備麻黃-杏仁藥對(duì)供試品溶液9份，分別精密加入高、中、低3個(gè)濃度麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷對(duì)照液1 ml（每個(gè)濃度3份），按上述色譜條件對(duì)三種成分進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率。結(jié)果麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷的平均加樣回收率分別為98.08%、99.78%、98.56%，RSD值分別為2.69%、1.55%、1.18%。

2.4樣品測(cè)定

選用均勻設(shè)計(jì)表Un（ns）來(lái)規(guī)劃實(shí)驗(yàn)，其中s為待考察因素，n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)和水平數(shù)。即對(duì)麻黃、杏仁兩個(gè)因素各取6個(gè)不同的水平并設(shè)計(jì)成6種配比進(jìn)行考察，選用U6（64）表。麻黃的藥典用量為1.5～10.0 g，杏仁的藥典用量為4.5～9.0 g。生藥總量100 g，均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)配比方案，結(jié)果如表1。

參照臨床煎藥方法，按照上表中各配比方量稱取藥材，將稱取的麻黃藥材加入方藥總量8倍的水，浸泡30 min，加熱至沸騰，然后改用小火煎煮30 min，加入苦杏仁藥材煎煮40 min，趁熱過(guò)濾，即得供試品溶液。供試品溶液各6份，分別進(jìn)樣10 μl，依次測(cè)定樣品中麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷的含量，折算成1 g生藥/ml的含量，結(jié)果如表2。

從表2可以看出，隨著麻黃用量的增加，麻黃堿和偽麻黃堿的含量也隨之增加。分別以麻黃用藥量為橫坐標(biāo)（x），麻黃堿或偽麻黃堿含量為縱坐標(biāo)（y），得線性回歸方程分別為y=0.0307x+0.2316，R2=0.9908；y=0.0397x-0.0033，R2=0.9967，表明麻黃堿和偽麻黃堿在麻黃-杏仁藥對(duì)中的含量與麻黃的用量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

隨著杏仁用量的增加，苦杏仁苷的含量也隨之增加。以杏仁用藥量為橫坐標(biāo)（x），苦杏仁苷含量為縱坐標(biāo)（y），得線性回歸方程為y=0.2015x+0.9631，R2=0.9969，表明苦杏仁苷在麻黃-杏仁藥對(duì)中的含量與杏仁的用量亦呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。且配伍比例的改變對(duì)麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷的含量均無(wú)明顯影響。

3討論

3.1分析方法選擇

目前文獻(xiàn)中報(bào)道的麻黃堿和偽麻黃堿定量方法主要有HPLC[11，17-18]和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[19-20]兩種；苦杏仁苷常用的定量方法有HPLC[21]和液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-QTOF-MS/MS）[22]。分析比較發(fā)現(xiàn)，HPLC、GC-MS和UPLC-QTOF-MS/MS分別用于麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷定量時(shí)，均有分離度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，又因HPLC設(shè)備使用維修成本較低，是目前應(yīng)用最為廣泛的藥物分析方法，故本研究選用HPLC對(duì)麻黃-杏仁藥對(duì)中麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷進(jìn)行定量分析。

3.2流動(dòng)相考察

以不同比例的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸作為流動(dòng)相考察，以甲醇-0.1%磷酸溶液（1.5∶98.5）為流動(dòng)相測(cè)定麻黃堿和偽麻黃堿時(shí)，以甲醇-0.1%磷酸溶液（15∶85）為流動(dòng)相時(shí)測(cè)定苦杏仁苷，峰型與分離效果均最佳。

3.3供試品溶液的選擇

為了更為準(zhǔn)確地測(cè)定各組分含量，且與對(duì)照品有更好的可比性，本研究對(duì)供試品溶液進(jìn)行了篩選。將1 g生藥/ml濃縮藥液作為供試品，結(jié)果響應(yīng)值相對(duì)過(guò)大；將濃縮液分別稀釋5、20、40倍后作為供試品，響應(yīng)值均相對(duì)不佳，且檢測(cè)取樣微量，考慮到稀釋過(guò)程對(duì)備用凍存濃縮液微量取樣也存在影響，故最終選擇未濃縮煎液作為供試樣品，響應(yīng)值相對(duì)較好，與對(duì)照品可比性好。測(cè)定其中各組分含量，再折算成1 g生藥/ml的濃度。用該方法計(jì)算得到的含量準(zhǔn)確可靠，可以作為麻黃-杏仁藥對(duì)質(zhì)量監(jiān)控方法。

3.4不同配伍比對(duì)麻黃-杏仁藥對(duì)中麻黃、偽麻黃、苦杏仁苷含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，隨著配伍比例的變化，麻黃堿、偽麻黃堿的含量與麻黃用量（R2分別為0.9908和0.9967）、苦杏仁苷和杏仁用量之間（R2=0.9969）均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；而配伍比例的改變對(duì)麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷的含量均無(wú)明顯影響，表明配伍比例對(duì)有效成分的含量無(wú)明顯影響，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[16]。而不同配伍比對(duì)麻黃-杏仁藥對(duì)的藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)影響均有待于進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2016-11-10 本文編輯：任 念）

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81460610）

[作者簡(jiǎn)介]楊麗（1977-），女，江西中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)藥學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生，研究方向：基礎(chǔ)藥學(xué)

通訊作者：李文宏（1974-），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)