朱艷琴， 殷勤紅， 虞 泓， 曾文波， 趙方允

(1.昆明理工大學分析測試研究中心，云南昆明 650093;2.云南大學中草藥生物資源研究所云百草實驗室，云南昆明 650093)

三七花是傳統(tǒng)名貴中藥五加科植物三七Panax Notoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥花蕾。三七花中含有各種人參皂苷［1］、三七花苷元［2］等。三七花作為藥材已載入《云南中草藥選》，“甘涼，清熱平肝，降壓。治療高血壓，頭昏，目眩，耳鳴，急性咽喉炎”;同時《中華本草》記載三七花“性甘味涼。清熱生津，平肝降壓。主治津傷口渴，咽痛音啞，高血壓病”。三七花［3-4］僅作為民間用藥材，其藥用價值未被充分利用。文獻中尚未有同時測定三七花中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的研究，本實驗建立同時測定三七花中3種皂苷的方法，為完善該藥材質(zhì)量標準提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DIONEXP680液相色譜儀 (P680四元梯度混合泵、ASI—100自動進樣器、UVD170U四通道紫外檢測器、TCC—100柱溫箱、CHROMELEONTM色譜信息管理軟件);BP211D電子天平(德國Sartorius公司);D101型大孔樹脂 (天津樹脂廠)。

1.2 試藥 三七皂苷R1(批號110745-200415)、人參皂苷Rg1(批號110703-200726)、人參皂苷Rb1(批號110704-200420)對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供;三氯甲烷、石油醚、乙醇、甲醇為分析純，乙腈為色譜純，水為重蒸水。

1.3 藥材 三七花于2009年8月采于云南省各地州，經(jīng)云南大學中草藥生物資源研究所云百草實驗室虞泓教授鑒定為五加科植物三七Panax Notoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥花蕾。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Hypersil ODS色譜柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫，0～10 min(25%A)，10～45 min(25% ～40%A)，45～60 min(40% ～55%A);檢測波長203 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫35℃;進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 (A)、樣品 (B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.2 對照品貯備液和對照品溶液的制備 分別精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對照品適量，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為470 μg/mL三七皂苷R1對照品貯備液、810μg/mL人參皂苷Rg1、1 220 μg/mL人參皂苷 Rb1對照品貯備液。再精密吸取貯備液適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為 9.4 μg/mL 三七皂苷 R1、40.5 μg/mL人參皂苷 Rg1、610 μg/mL人參皂苷 Rb1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末，精密稱定1.0 g置索氏提取器中，加三氯甲烷100 mL，加熱回流4 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，加甲醇100 mL，加熱回流4 h，提取液揮干，加水20 mL使溶解，加石油醚 (30～60℃)提取2次，每次20 mL，棄去醚液，水液通過D101型大孔樹脂柱 (內(nèi)徑1.5 cm，長15 cm)，以水100 mL洗脫，棄去水液。再用20%乙醇100 mL洗脫，棄去20%乙醇洗脫液，繼用80%乙醇150 mL洗脫，收集洗脫液140 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定量轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關系考察 分別進樣2、5、10、20、40 μL的上述混合對照品溶液，以峰面積為縱坐標，進樣量 (μg)為橫坐標繪制標準曲線。三七皂苷R1的回歸方程為Y=3.236 8X+0.014 4，r=0.999 7，在0.018 8 ～0.376 μg范圍內(nèi)峰面積與進樣量呈良好的線性關系;人參皂苷Rg1的回歸方程為Y=1.042 6X－0.009 2，r=0.999 7，在0.081～1.62 μg范圍內(nèi)峰面積與進樣量呈良好的線性關系;人參皂苷 Rb1的回歸方程為Y=0.647 6X+0.011 2，r=0.999 9，在 1.22～24.4 μg范圍內(nèi)峰面積與進樣量呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 分別吸取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，RSD分別為三七皂苷R11.66%，人參皂苷Rg11.40%，人參皂苷Rb10.94%。表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定試實驗 取供試品溶液，照上述色譜條件，分別于0、2、4、6 h測定峰面積，RSD分別為三七皂苷R11.34%，人參皂苷Rg11.36%，人參皂苷Rb10.89%。表明樣品中3種成分在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗 按供試品溶液制備方法項下操作，平行制備6份樣品，照上述色譜條件，分別測定3種成分，RSD分別為三七皂苷R11.41%，人參皂苷Rg11.23%，人參皂苷Rb10.63%。表明供試品溶液的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取三七皂苷R1對照品6.3 mg至100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取10 mL至50 mL量瓶并用甲醇定容，作為三七皂苷R1加樣對照品溶液;精密稱取人參皂苷Rg1對照品9.1 mg至100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取20 mL至50 mL量瓶并用甲醇定容，作為人參皂苷Rg1加樣對照品溶液;精密稱取人參皂苷Rb1對照品38.6 mg至50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為人參皂苷Rb1加樣對照品溶液。稱取已知含有量的硯山縣維摩鄉(xiāng)樣品6份各0.5 g，精密加入上述3種加樣對照品溶液各5 mL，按供試品溶液制備項下方法制成加樣回收供試液，在上述色譜條件下進樣分析，計算回收率。結果見表1。

2.9 樣品測定 精密吸取對照品溶液與供試品溶液按上述色譜條件，注入液相色譜儀，記錄峰面積，用外標法計算樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的量。結果見表2。

3 討論

3.1 實驗中參考《中國藥典》2010年版一部中三七［5］的質(zhì)量標準并參考相關文獻［6-14］，選擇乙腈-水為溶劑系統(tǒng)，并對梯度洗脫時間和比例進行適當調(diào)整，以滿足3種成分獲得較好的分離效果。

表1 加樣回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery tests

表2 三七花中3種皂苷的測定結果Tab.2 Determination of 3 ginsenosides in Notoginseng Flos

3.2 三七花中所含成分較多，并含有大量葉綠素，因此參照《中國藥典》2010年版一部中人參葉的樣品處理方法，選用D101型大孔吸附樹脂進行洗脫，先用水洗去多糖，再用20%乙醇洗去黃酮類物質(zhì)，最后收集80%乙醇洗脫液，表明此法可起到較好的純化作用。

3.3 上述實驗結果表明，采于云南各地的三七花藥材各成分之間略有差別，其中人參皂苷Rb1含有量差異不大，而三七皂苷R1和人參皂苷Rg1含有量差異較大，這可能與三七花藥材的產(chǎn)地、種植條件、采收期等有關。

［1］Taniyasu S，Tanaka O，Yang T R，et al.Dammarane saponins of flower buds ofPanax notoginseng(Sanchi-Ginseng)［J］.Planta Med，1982，44(2):124-125.

［2］魏均嫻，劉 莉，徐榕雪.三七花皂甙元的研究［J］.中藥通報，1984，9(5):223-225.

［3］張燕麗，左冬冬.三七花的現(xiàn)代研究進展［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28(1):116-118.

［4］殷勤紅，朱艷琴，虞 泓，等.三七花化學成分和藥理作用的研究進展［J］.光譜實驗室，2011，28(3):1194-1197.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:11-12.

［6］沈 嵐，馮 怡，徐德生，等.比色法測定三七花中總皂苷的含量［J］.中成藥，2007，29(9):1368-1370.

［7］沈 嵐，馮 怡，徐德生，等.反相高效液相色譜法測定三七花中人參皂苷Rb1的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(6):1482-1483.

［8］張 冰，陳曉輝，畢開順.HPLC法同時測定三七花中人參皂苷Rb1和三七皂苷 Fe的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30(2):233-235.

［9］張 敏，胡 坪，羅國安，等.三七剪口指紋圖譜研究及應用［J］.中草藥，2007，38(3):442-445.

［10］繆 紅，張海歡，王小萍.大孔吸附樹脂富集純化三七花總皂苷工藝研究［J］.中國藥房，2011，22(39):3680-3683.

［11］韓 杰，孔祥文，李東輝.HPLC法同時測定骨刺寧膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1［J］.中成藥，2011，33(5):824-826.

［12］高明菊，王 強，張 勤，等.七丹膠囊中4個成分的HPLC分析［J］.中成藥，2010，32(5):782-786.

［13］宋金玉，康博欣，朱鴻敏，等.HPLC-ELSD同時測定燈銀腦通膠囊中白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29(4):532-535.

［14］何選林，王群英.三七膠囊含量測定方法的改進［J］.中成藥，2011，33(3):461-463.