謝仲德， 方應(yīng)權(quán)， 李文烈， 夏天水

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，重慶萬州 404020;2.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北石家莊 050035;3.成都倍特藥業(yè)有限公司，四川成都 610041)

當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊是由當(dāng)歸、熟地黃、川芎、黨參、白芍、甘草和黃芪組成的復(fù)方制劑。具有補(bǔ)血助氣，調(diào)經(jīng)功效，用于貧血衰弱，病后、產(chǎn)后血虛以及月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)［1］。是在原當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒［已收載于《部頒中藥成方制劑》第10冊 (WS3-B-1925-95)］的基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝改良而制備的新制劑，具有療效好、服用劑量小的特點(diǎn)。采用薄層色譜法對制劑中的當(dāng)歸、川芎、白芍進(jìn)行了定性鑒別研究，采用高效液相色譜法建立阿魏酸、芍藥苷的定量測定方法。

1 儀器與試藥

紫外分光光度計(jì) (島津UV-3150)、恒溫水浴鍋 (余姚精益溫度儀表廠)、硅膠G(青島海洋化工有限公司)、高效液相色譜法儀 (北京創(chuàng)新通恒科技有限公司高效液相色譜儀:D3000高壓輸液泵，UV2000紫外分光檢測器)、電子天平 (BS-224S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。當(dāng)歸對照藥材 (批號(hào)9271-9905)、川芎對照藥材 (批號(hào)0919-200004)、阿魏酸對照品 (批號(hào)0773-9910)、芍藥苷對照品 (批號(hào)0736-200014)均購自中國藥品生物制品檢定所?；瘜W(xué)試劑為分析純。當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊 (批號(hào)110201、110202、110203，自制)。

2 薄層鑒別

2.1 當(dāng)歸、川芎的薄層色譜鑒別［2］取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品10粒，研細(xì)，取粉末2 g至燒杯中，加水10 mL溶解，加乙醇40 mL，邊加邊攪拌，傾溶液至蒸發(fā)皿中，置水浴上蒸去乙醇至約10 mL，移至分液漏斗中，用少量水洗滌蒸發(fā)皿，洗滌液倒入分液漏斗中，用乙醚振搖提取2次，每次15 mL，合并乙醚提取液，再向上述乙醚溶液中加2%碳酸鈉溶液振搖提取2次，每次15 mL，棄去乙醚液，提取液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，用少量苯洗滌，棄去苯液，再用乙醚振搖提取2次，每次30 mL，合并乙醚提取液，揮干，殘?jiān)右掖? mL溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸和川芎對照藥材各1 g，分別加水100 mL，煎煮1 h，濾過，濾液濃縮至約10 mL，分別加乙醚振搖提取2次，每次15 mL，合并乙醚提取液，揮去乙醚，殘?jiān)右掖? mL使溶解，分別制成當(dāng)歸和川芎的對照藥材溶液。另取阿魏酸對照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法 (中國藥典2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述各溶液各10 μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-冰醋酸-甲醇 (30∶1∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈 (365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，見圖1。

2.2 白芍的薄層色譜鑒別［3］取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品10粒，研細(xì)，取粉末2 g，加水20 mL加熱溶解，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用水洗滌萃取液2次，每次20 mL。正丁醇液置水浴上濃縮至約1 mL，加中性氧化鋁0.5 g，拌勻，干燥，裝入中性氧化鋁柱 (100～200目，約1 g，內(nèi)徑1～1.5 cm)上，以乙酸乙酯-甲醇 (1∶1)30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取白芍對照藥材的粉末1 g，加乙醇15 mL，振搖5 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，制成白芍的對照藥材溶液。另取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法 (中國藥典2010年版一部附錄ⅤI B)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-乙酸 (10∶4∶6∶0.8)為展開劑，展開，取出，晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照液色譜中無干擾，見圖2。

圖1 當(dāng)歸、川芎 (阿魏酸)的TLC色譜圖

3 HPLC測定當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊中阿魏酸

3.1 色譜條件［4-7］Kromasil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-乙腈-1%冰乙酸溶液 (5∶1∶10);體積流量1.0 mL/min;柱溫為室溫;檢測波長為323 nm;進(jìn)樣量10 μL;阿魏酸出峰時(shí)間為20 min;理論板數(shù)按阿魏酸計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

圖2 白芍 (芍藥苷)的TLC色譜圖

3.2 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào)110201)10粒，研細(xì)，取粉末5 g，精密稱定，置分液漏斗中，用20 mL水溶解，加少量氯化鈉，用二氯甲烷提取4次 (每次20 mL)，合并二氯甲烷層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器揮干并回收二氯甲烷，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL量瓶中，作為供試品溶液。

3.4 陰性樣品溶液的制備 按當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊處方和制法，制成缺當(dāng)歸和白芍陰性制劑，精密稱取5 g，再按供試品溶液制備方法制備陰性溶液。進(jìn)樣20 μL測定，結(jié)果表明陰性樣品對阿魏酸測定無干擾，見圖3。

圖3 阿魏酸對照品 (A)、供試品 (B)及陰性樣品 (C)的HPLC色譜圖

3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密稱取阿魏酸對照品7.68 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，作為貯備液 (0.307 2 mg/mL)。精密量取貯備液0.5、1、2、4、8 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以阿魏酸的峰面積值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程為:Y=5×107X，r=1，標(biāo)準(zhǔn)曲線為通過原點(diǎn)的一條直線，所以可以用外標(biāo)一點(diǎn)法測定計(jì)算阿魏酸。結(jié)果表明阿魏酸在0.015 4～0.245 8 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

3.6 精密度試驗(yàn) 取同一對照品溶液 (質(zhì)量濃度為51.2 μg/mL)及同一供試品樣品 (批號(hào)110201)溶液各重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，觀察其重復(fù)性。結(jié)果表明，對照品溶液阿魏酸峰面積的RSD為1.52%，供試品阿魏酸峰面積的RSD為0.93%，表明本法精密度好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、2、4、6、8 h精密吸取阿魏酸對照品溶液 (質(zhì)量濃度為51.2 μg/mL)及供試品溶液(批號(hào)110201)各20 μL注入液相色譜儀測定，對照品溶液峰面積的RSD為0.429%，供試品溶液峰面積的RSD為0.619%。結(jié)果表明，對照品及供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊 (批號(hào)110201)5份，分別精密稱定，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，另取阿魏酸對照品適量，加甲醇制成1 mL含阿魏酸對照品0.048 mg的對照品溶液。

精密吸取供試品、對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，以甲醇-乙腈-1%冰乙酸溶液 (5∶1∶10)為流動(dòng)相，測定，計(jì)算供試品溶液的RSD為1.83%，結(jié)果表明，方法重現(xiàn)性良好。

3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已測定的當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊試制樣品3批 (批號(hào):110201、110202、110203)，各3份，約0.5 g，精密稱定，分別按其含有量的80%、100%、120%加入阿魏酸對照品適量，按供試品溶液的制備方法，制成供試品溶液，依法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.10%，RSD為1.37%。見表1。

表1 阿魏酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3.10 樣品測定 精密稱取3批當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào):110201、110202、110203，每批制成3份供試品)各5 g，按供試品溶液的制備方法，制成供試品溶液，分別按3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品中阿魏酸測定結(jié)果 (n=3)

根據(jù)測定結(jié)果，每1 g樣品中阿魏酸量最高為:0.346 2 mg，最低為:0.304 2 mg，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.324 1 mg/g，結(jié)合廠方工藝提取率以及藥材質(zhì)量的差異，故本制劑阿魏酸含有量暫定為:每1 g樣品含阿魏酸 (C10H10O4)不得少于0.300 0 mg。

4 HPLC測定當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊中芍藥苷

4.1 色譜條件［8-11］Kromasil-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水 (18∶82);體積流量1.0 mL/min;柱溫為室溫;檢測波長為280 nm;進(jìn)樣量10 μL;芍藥苷出峰時(shí)間為23 min;理論板數(shù)按阿魏酸計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

4.2 對照品溶液的制備 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。

4.3 供試品溶液的制備 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào)110201)10粒，研細(xì)，取粉末5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞稱定質(zhì)量。超聲處理25 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

4.4 陰性樣品溶液的制備 按當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊處方和制法，制成缺白芍陰性制劑，精密稱取5 g，再按供試品溶液制備方法制備陰性溶液。進(jìn)樣10 μL測定，結(jié)果表明陰性樣品對芍藥苷測定無干擾，見圖4。

4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密稱取芍藥苷對照品8.02 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，作為貯備液 (0.401 mg/mL)。精密量取貯備液0.5、1、2、4、8 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以芍藥苷的峰面積值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程為:Y=2×107X，r=0.999 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線為通過原點(diǎn)的一條直線，所以可以用外標(biāo)一點(diǎn)法測定計(jì)算芍藥苷的量。結(jié)果表明芍藥苷在0.020 05～0.320 8 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖4 芍藥苷對照品 (A)、供試品 (B)及陰性樣品 (C)的HPLC色譜圖

4.6 精密度試驗(yàn) 取同一對照品溶液 (質(zhì)量濃度為40.1 μg/mL)及同一供樣品 (批號(hào)110201)溶液各重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，觀察其重復(fù)性。結(jié)果表明，對照品溶液芍藥苷峰面積的RSD為1.28%，供試品芍藥苷峰面積的RSD為1.53%，表明儀器精密度好。

4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、2、4、6、8 h精密吸取芍藥苷對照品溶液 (質(zhì)量濃度為40.1 μg/mL)及供試品溶液(批號(hào)110201)各20 μL注入液相色譜儀測定，對照品溶液峰面積的RSD為1.68%，供試品溶液峰面積的RSD為1.75%。結(jié)果表明，對照品及供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊 (批號(hào)110201)5份，分別精密稱定，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，另取芍藥苷對照品適量，加甲醇制成1 mL含芍藥苷對照品40 μg的對照品溶液。

精密吸取供試品、對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，測定，計(jì)算供試品中芍藥苷的量，其RSD為1.95%，結(jié)果表明，本法方法重復(fù)性良好。

4.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已測定的當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊試制樣品3批 (批號(hào):110201、110202、110203)，各3份，約2.5 g，精密稱定，分別按其含有量的80%、100%、120%加入芍藥苷對照品適量，按供試品溶液的制備方法，制成供試品溶液，依法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.05%，RSD為1.02%。見表3。

表3 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

4.10 樣品測定 精密稱取3批當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào):110201、110202、110203，每批制成3份供試品)各5 g，按供試品溶液的制備方法，制成供試品溶液，分別按3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表4 樣品芍藥苷測定結(jié)果 (n=3)

根據(jù)測定結(jié)果，每1 g樣品中芍藥苷量最高為0.122 8 mg，最低為0.120 5 mg，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.121 4 mg/g，結(jié)合廠方工藝提取率以及藥材質(zhì)量的差異，故本制劑芍藥苷含有量暫定為每1 g樣品含芍藥苷不得少于0.120 0 mg。

5 討論

經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，通過優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方法和展開劑，對當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊中當(dāng)歸、川芎、白芍進(jìn)行TLC鑒別，其色譜特征斑點(diǎn)清晰、專屬性強(qiáng)，所以此3味中藥可用于該制劑的定性鑒別。川芎、當(dāng)歸均有活血調(diào)經(jīng)、化瘀止痛的功效，其有效成分均為阿魏酸［12］、芍藥苷，對婦女月經(jīng)不調(diào)有很強(qiáng)的藥理作用，所以阿魏酸、芍藥苷可以作為該制劑的指標(biāo)性成分。當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊每1 g樣品中阿魏酸不得低于0.300 0 mg/g和芍藥苷不得低于0.120 0 mg，以此作為該制劑定量測定指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)選用甲醇-乙腈-1%冰乙酸溶液作流動(dòng)相，增加甲醇量可改變峰形，減少拖尾，但甲醇比例過高，分離效果下降，不易與雜質(zhì)峰分離。另外加入1%冰乙酸主要是調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，縮短分離時(shí)間，改善分離度。

［1］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999:893.

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