陳穎翹，王 麗，鐘青萍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

1982年Xu 等［1］首次在河口和海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)生存但不可培養(yǎng)的霍亂弧菌和大腸桿菌.Colwell等［2-3］提出微生物的“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”(viable but non-culturable，VBNC)的概念，并于2000年首次撰寫了有關(guān)VBNC 狀態(tài)微生物的研究綜述與專著.最新的研究認(rèn)為處于VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌并非趨向于死亡，只是為了適應(yīng)不良環(huán)境所做出的一種程序式反應(yīng)，是一種生存策略［4］.不同細(xì)菌及同一細(xì)菌的不同菌株其進(jìn)入VBNC 狀態(tài)的條件及機理各不相同.常見的誘導(dǎo)微生物進(jìn)入VBNC 狀態(tài)的因素可分為物理因素(如溫度、濕度、氧氣濃度、光照度等)、化學(xué)因素(營養(yǎng)成分、有害化學(xué)物質(zhì)等)及生物因素.

金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus 是一種重要的病原菌，可引起許多嚴(yán)重感染.美國疾病預(yù)防控制中心報告顯示，由金黃色葡萄球菌引起的感染居第2 位，僅次于大腸埃希菌.金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)一般有如下特點:季節(jié)分布多見于春夏季;中毒食品種類多，如奶、肉、蛋、魚及其制品.魯梅芳等［5］在4 和-20℃條件下，用添加0.01～0.05 mmol/L的銅離子的方法誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌進(jìn)入VBNC 狀態(tài)，并發(fā)現(xiàn)進(jìn)入VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌呈現(xiàn)不規(guī)則球形，但細(xì)胞形態(tài)完整，沒有細(xì)胞壁的破裂.有研究表明金黃色葡萄球菌進(jìn)入VBNC 狀態(tài)的機制與突變失活的抗氧化基因有關(guān)［6］.

VBNC 的細(xì)菌在一定條件下可以復(fù)蘇，細(xì)菌VBNC 狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)和研究對于流行病學(xué)、食品安全、水質(zhì)監(jiān)測、食品衛(wèi)生檢驗等許多方面都具有重要的意義.本研究采用食品防腐劑山梨酸鉀等條件誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌進(jìn)入VBNC 狀態(tài)，對其進(jìn)行復(fù)蘇，并考察復(fù)蘇菌株的生理生化代謝特征及應(yīng)激抵抗力.本研究為了解食品防腐劑等條件下金黃色葡萄球菌是否進(jìn)入VBNC 狀態(tài)，以及復(fù)蘇菌株的生理特性提供了理論依據(jù)，對更新傳統(tǒng)的致病菌檢測觀念和加強食品安全控制亦具有積極的意義.

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(編號26003)，購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，菌株在4℃條件下保存于含75 g/L NaCl 的營養(yǎng)瓊脂斜面上.

1.2 主要試劑與儀器

營養(yǎng)瓊脂、肉湯(含75 g/L NaCl)、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、血瓊脂平板均購于廣州環(huán)凱微生物科技有限公司，純度均大于97%.API STAPH 試劑條(法國生物梅里埃公司);正立顯微鏡及顯微數(shù)碼相機系統(tǒng)(德國Leica 公司);掃描電鏡(德國TVIPS 公司);5417R 高速冷凍離心機(德國Eppendorf 股份有限公司);生物安全柜(Thermo 公司).

1.3 試驗方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌VBNC 狀態(tài)的誘導(dǎo) 將金黃色葡萄球菌接種于BHI 培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期.在充分考慮溫度、山梨酸鉀以及富營養(yǎng)(含75 g/L NaCl 的肉湯)和寡營養(yǎng)(質(zhì)量濃度為75 g/L 的NaCl 溶液)的影響的基礎(chǔ)上，結(jié)合金黃色葡萄球菌的生理特性，最終確定誘導(dǎo)方案為6 種:1)10 mmol/L 山梨酸鉀、富營養(yǎng)、37℃;2)10 mmol/L 山梨酸鉀、寡營養(yǎng)、4℃;3)5 mmol/L 山梨酸鉀、富營養(yǎng)、-20℃;4)5 mmol/L 山梨酸鉀、寡營養(yǎng)、37℃;5)0.5 mmol/L 山梨酸鉀、富營養(yǎng)、4℃;6)0.5 mmol/L 山梨酸鉀、寡營養(yǎng)、-20℃.分別吸取1 mL 對數(shù)生長期的菌液至1.5 mL 的離心管中，4℃條件下，5 000 r/min離心10 min.收集沉淀后，用1 mL 滅菌蒸餾水混懸菌液，分別接種到上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，搖勻，在不同條件下進(jìn)行誘導(dǎo).

1.3.2 細(xì)菌計數(shù)方法 每隔4 d 取樣測定活菌數(shù)，10 d 后每隔8 d 取樣.采用涂布平板法檢測活細(xì)菌數(shù)的變化，選擇合適稀釋度的菌懸液100 μL 涂布營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)，次日觀察計數(shù).當(dāng)無菌落生長時，加大接種量，連續(xù)培養(yǎng)3 d 后，均無菌落生長，即可認(rèn)為試驗樣品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài).

1.3.3 VBNC 狀態(tài)金黃色葡萄球菌的復(fù)蘇 分別采用肉湯(含75 g/L NaCl)、BHI 液體培養(yǎng)基升溫的方法對VBNC 狀態(tài)的金黃色葡萄球菌進(jìn)行復(fù)蘇，具體操作如下:取0.5 mL VBNC 狀態(tài)的金黃色葡萄球菌菌液，分別加入至5 mL 無菌的肉湯、BHI 液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培育，每隔24 h 取合適稀釋度的VBNC 菌液100 μL 涂布營養(yǎng)瓊脂平板，于37℃培養(yǎng)，觀察是否有金黃色葡萄球菌菌落長出.并繪制VBNC 狀態(tài)金黃色葡萄球菌復(fù)蘇生長曲線.

1.3.4 復(fù)蘇后金黃色葡萄球菌的形態(tài)觀察 將復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌劃線于血平板上，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并將復(fù)蘇后的菌體進(jìn)行革蘭氏染色和掃描電鏡觀察，描述細(xì)菌個體形態(tài)特征.

1.3.5 復(fù)蘇后金黃色葡萄球菌的生理生化檢測對復(fù)蘇的金黃色葡萄球菌進(jìn)行生理生化檢測，采用法國生物梅里埃公司的API 系統(tǒng)(API STAPH 試劑條)進(jìn)行.根據(jù)說明書判斷反應(yīng)，參照分析圖索引和鑒定軟件可以得出鑒定的結(jié)果.

1.3.6 復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌對環(huán)境應(yīng)激的敏感性 將復(fù)蘇的金黃色葡萄球菌和正常狀態(tài)的菌體分別在BHI 増菌液中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將菌懸液5 000 r/min 離心15 min，收集細(xì)胞，用適量體積的PBS(pH 7.2)洗滌，稀釋到適當(dāng)濃度用于環(huán)境應(yīng)激試驗，每項試驗設(shè)計2 個重復(fù)，每個稀釋度做2 個平行.

紫外線輻射:分別吸取0.1 mL 適當(dāng)濃度的正常和復(fù)蘇的菌懸液，涂布血平板，無菌條件下紫外線照射0、30、60、90 s.紫外燈功率15 W，照射距離50 cm，照射結(jié)束后置于暗處避光修復(fù)10 min，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計數(shù)并計算存活率［7］.

高滲透壓處理:正常和復(fù)蘇的菌體細(xì)胞置于PBS 中(含2.5 mol/L NaCl)，分別在室溫下放置0、30、60、90 min 后取樣，涂布血平板，37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計數(shù)并計算存活率［8］.

熱激處理:正常和復(fù)蘇的菌體細(xì)胞用預(yù)熱的PBS(72℃)懸浮，再置于72℃的水浴中分別處理0、5、10、15 s 后取樣，迅速冰浴冷卻，涂布血平板，37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計數(shù)并計算存活率［8］.

冷激處理:正常和復(fù)蘇的菌體細(xì)胞用預(yù)冷的PBS(4℃)懸浮，分別在4℃冰箱中處理0、30、60、90 min 后取樣涂布血平板，37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計數(shù)并計算存活率［9］.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)條件下金黃色葡萄球菌數(shù)量變化規(guī)律

經(jīng)過一定時間的誘導(dǎo)，隨著誘導(dǎo)時間的延長，可培養(yǎng)菌的總數(shù)不斷減少，下降最慢的是10 mmol/L山梨酸鉀富營養(yǎng)狀態(tài)37℃的誘導(dǎo)方案(誘導(dǎo)方案1)，當(dāng)至132 d 時，總數(shù)下降為0，說明誘導(dǎo)成功.另外5 種誘導(dǎo)方案分別于84、84、85、85 和76 d 進(jìn)入VBNC 狀態(tài)，結(jié)果如圖1.

圖1 金黃色葡萄球菌存活曲線Fig.1 The survival curve of Staphylococcus aureus

2.2 VBNC 狀態(tài)金黃色葡萄球菌的復(fù)蘇

分別采用肉湯(含75 g/L NaCl)、BHI 液體培養(yǎng)基升溫的方法對VBNC 狀態(tài)的金黃色葡萄球菌進(jìn)行復(fù)蘇，每隔24 h 取合適稀釋度的菌液100 μL 涂布營養(yǎng)瓊脂平板，于37℃培養(yǎng).發(fā)現(xiàn)采用肉湯培養(yǎng)基升溫的方法不能使菌體復(fù)蘇，培養(yǎng)20 d 后仍未見有菌落長出.而采用BHI 液體培養(yǎng)基升溫復(fù)蘇法培養(yǎng)2 d 時，取樣涂布營養(yǎng)瓊脂平板可見有大小一致的金黃色葡萄球菌單一菌落，菌數(shù)為102cfu/mL.隨著復(fù)蘇時間的延長，可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)迅速增加，至120 h 時，可培養(yǎng)菌數(shù)約為107cfu/mL(圖2).表明BHI 液體培養(yǎng)基復(fù)蘇法可使VBNC 狀態(tài)的金黃色葡萄球菌復(fù)蘇.

圖2 VBNC 狀態(tài)金黃色葡萄球菌在BHI 液體培養(yǎng)基中的復(fù)蘇曲線Fig.2 The resuscitation curve of Staphylococcus aureus from VBNC state in BHI medium

2.3 復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌的形態(tài)特征

復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)與正常狀態(tài)的菌落形態(tài)都是表面光滑濕潤、凸起、邊緣整齊，但正常狀態(tài)的菌落呈金黃色，復(fù)蘇后的菌落呈乳白色，并且沒有溶血圈.

經(jīng)過革蘭染色和掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇后與正常狀態(tài)的金黃色葡萄球菌均呈球形，成葡萄串狀，無芽孢，無莢膜，革蘭染色陽性(圖3).

圖3 正常狀態(tài)和復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌的掃描電鏡觀察Fig.3 Morphological characteristics of the normal and resuscitative cells of Staphylococcus aureus by scanning electron microscope

2.4 復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌的生理生化特性

使用法國生物梅里埃公司的API STAPH 生化鑒定試劑盒對復(fù)蘇的金黃色葡萄球菌進(jìn)行生化鑒定，按照API STAPH 生化反應(yīng)表對反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行判讀和記錄:標(biāo)準(zhǔn)菌株與復(fù)蘇菌株均可分解D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、麥芽糖、乳糖、D-海藻糖、D-甘露醇、蔗糖和N-乙酰-葡萄糖甙，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;能還原硝酸鹽至亞硝酸鹽;分解丙酮酸鈉為乙酰-甲基-甲醇，水解精氨酸;不能分解木醇、D-蜜二糖、棉籽糖、木糖和α-甲基-D-酸性磷酸鹽.但與標(biāo)準(zhǔn)菌株不同的是復(fù)蘇菌株不能水解尿素.將上述鑒定得到的生化譜輸入軟件，得到鑒定結(jié)果，金黃色葡萄球菌鑒定百分比為98.1%.復(fù)蘇后的菌株除尿素酶陰性外，其他代謝特征均與標(biāo)準(zhǔn)菌株相同，以此可以推斷VBNC 狀態(tài)的金黃色葡萄球菌經(jīng)過復(fù)蘇，基本恢復(fù)了正常的代謝過程.

2.5 復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌對環(huán)境應(yīng)激的抵抗力

紫外照射時，正常的和復(fù)蘇的金黃色葡萄球菌的存活率隨著時間的延長而逐漸降低，正常的細(xì)胞存活率比復(fù)蘇細(xì)胞存活率略大，照射90 s 后2 種狀態(tài)的菌體全部失去培養(yǎng)能力(圖4a).在熱激(72℃)條件下，正常和復(fù)蘇的細(xì)胞的存活率隨著處理時間的延長迅速降低，處理5 s 后，正常細(xì)胞存活率僅為1.2%，復(fù)蘇細(xì)胞已經(jīng)降為0%，15 s 后兩種狀態(tài)的細(xì)胞全部失去培養(yǎng)能力(圖4b).冷激(4℃)條件下，正常和復(fù)蘇的細(xì)胞存活率均有所下降，90 min 后正常細(xì)胞存活率為41%，比復(fù)蘇細(xì)胞存活率高(圖4c).高滲條件下保持90 min 后，正常狀態(tài)細(xì)胞的存活率為10%，復(fù)蘇細(xì)胞的存活率為9%(圖4d).

圖4 環(huán)境應(yīng)激對不同狀態(tài)金黃色葡萄球菌存活率的影響Fig.4 Effects of environmental stress on survival of Staphylococcus aureus in different states

3 討論與結(jié)論

活的非可培養(yǎng)狀態(tài)是細(xì)菌抵抗不良環(huán)境的一種生存方式，不同細(xì)菌對外界環(huán)境壓力的耐受性不同［10］.本文研究了食品防腐劑條件下金黃色葡萄球菌的VBNC 狀態(tài)，將金黃色葡萄球菌置于適量山梨酸鉀、富營養(yǎng)或寡營養(yǎng)狀態(tài)下，分別于常溫和低溫下誘導(dǎo)，都能使其進(jìn)入VBNC 狀態(tài).其中，10 mmol/L 山梨酸鉀、富營養(yǎng)狀態(tài)、37℃誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)時間長達(dá)132 d.而魯梅芳等［5］采用低溫、銅離子溶液誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌4 d 內(nèi)就能進(jìn)入VBNC 狀態(tài).國內(nèi)外的研究顯示，VBNC 的誘導(dǎo)因素多樣，不同種類的細(xì)菌，同種不同株的細(xì)菌，誘導(dǎo)因素亦不同，但這些因素變化均是向著不利于正常細(xì)胞存活的方向.

楊政［11］將進(jìn)入VBNC 狀態(tài)的金黃色葡萄球菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)，實現(xiàn)了復(fù)蘇.但本試驗用該方法無法起到復(fù)蘇的作用，而接入BHI 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 d 后，細(xì)菌數(shù)量達(dá)到102cfu/mL.分析其原因可能是本試驗中進(jìn)入VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌對培養(yǎng)的營養(yǎng)條件要求增加，而BHI 培養(yǎng)基比普通肉湯營養(yǎng)更高，能給VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌提供充分的營養(yǎng)，從而使其恢復(fù)到可培養(yǎng)狀態(tài).復(fù)蘇后的細(xì)胞大小與形態(tài)與正常狀態(tài)相同，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整.復(fù)蘇后的細(xì)胞除了脲酶呈陰性外，其他生理生化代謝基本恢復(fù).該結(jié)果與郝小斌等［12］研究結(jié)果相似，脲酶由脲酶基因簇(ure)編碼，復(fù)蘇后菌株脲酶陰性，說明ure 在VBNC 狀態(tài)或復(fù)蘇時發(fā)生了變化.

有研究報道發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌菌落呈金黃色是因為產(chǎn)類胡蘿卜素的緣故［13］，而類胡蘿卜素具有抗氧化功能［14-15］，通過長期研究發(fā)現(xiàn)，這種類胡蘿卜素能夠幫助金黃色葡萄球菌抵御外來殺傷［16］，當(dāng)研究人員將金黃色葡萄球菌中的類胡蘿卜素基因敲除后，它們就容易被殺死，而研究人員進(jìn)一步將類胡蘿卜素轉(zhuǎn)入一種威脅性很小的鏈球菌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鏈球菌不僅變成了金黃色，而且變得更具危險性［17］.復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌對紫外照射、溫度應(yīng)激和高滲透壓的抵抗能力都比正常狀態(tài)的金黃色葡萄球菌弱，這可能與復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌不產(chǎn)類胡蘿卜素有關(guān).

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